摘要
本研究旨在评估噬菌体混合物在冷藏储存期间改善五种不同混合叶类沙拉的微生物学质量的有效性：芝麻菜、胡萝卜混合叶沙拉、甜菜根混合叶沙拉、清洗和未清洗的菠菜。肠杆菌目杆菌是测试产品中的重要细菌群。对选定的细菌进行抗生素耐药性谱测试，然后用于寻找特异性噬菌体。从污水中分离出43株靶向混合叶沙拉中优势菌的噬菌体。测定了它们的滴度，并使用Bioscreen C Pro自动生长曲线分析仪评估了裂解活性。包括喷洒和吸收垫两种噬菌体混合物应用方法对芝麻菜、胡萝卜混合叶沙拉和甜菜根混合叶沙拉有效。孵育48小时后，最大降低水平达到99.9%（与对照样品相比）。在清洗和未清洗的菠菜中，减少微生物数量的尝试未达到预期效果。生菜混合物中细菌数量的降低取决于本地腐生细菌物种的组成。两种噬菌体混合物应用方法均有效改善了最低限度加工产品的微生物学质量。全谱噬菌体混合物的应用可能构成一种不影响食品的替代食品微生物学质量改善方法。
1. 引言
消费者饮食习惯的改善和对新的健康促进产品的寻求导致了对最低限度加工食品兴趣的增加。这些产品使用非热技术保存，导致食品质地变化有限。这种方法还允许保存生物活性成分，如维生素、维生素原和植物营养素，这些成分在植物来源的最低限度加工食品中天然大量存在。
最低限度加工技术使用几种物理食品保存方法，包括高静水压、辐射、超声和脉冲电场。还采用真空低温和冷却包装技术、保护性可食用涂层、改良气氛包装和储存。上述食品保存方法的使用可能对产品的感官特性或营养价值产生负面影响。此外，并非所有方法都能有效减少保存产品的微生物污染。高静水压对营养细胞具有杀菌作用，但如果不使用额外技术（如热处理），孢子不会被完全灭活，这在果汁被脂环酸芽孢杆菌属细菌污染的情况下可能很重要，或其他食品被芽孢杆菌属细菌污染的情况。电离辐射有效减少病原细菌的生长，但即使小剂量（0.5 kGy）也会降低叶类蔬菜的质量。尽管美国食品药品监督管理局推荐高剂量辐射来有效保存冰山生菜，但这可能导致细胞汁液泄漏。超声也不能用于保存植物来源的最低限度加工食品，因为与高剂量电离辐射一样，它会导致细胞内容物泄漏到环境中。细胞汁液释放到包装中是腐生微生物生长和发育的良好培养基，这些微生物天然存在于产品表面。腐生细菌生长的加剧降低了产品质量（味道、气味、颜色的变化）。脉冲电场能够灭活微生物，同时保护食品所需的感官和物理特性。然而，脉冲电场诱导蛋白质的构象变化，因此可能影响天然酶的活性。植物来源产品的质量取决于储存气氛。研究证实了可控气氛包装对食品感官质量的积极影响，特别是在红点和叶缘褐变的背景下。总之，食品工业中物理方法的使用并不总是保证具有令人满意感官特性和微生物学质量的食品产品。
关于保存具有最高微生物学风险的最低限度加工食品的生物方法越来越受到关注，如鲜榨果汁、豆芽或沙拉混合物。使用保护性微生物的概念已经广为人知，但另一种方法可能是使用天然"敌人"，即噬菌体。噬菌体的使用可以通过延长保质期而不影响其物理特性来满足消费者对最低限度加工食品的期望。噬菌体是高度特异性的细菌病毒，通常只能感染一种细菌物种或菌株，与抗生素不同，不会破坏人体消化道的天然共生微生物群。研究表明，噬菌体对食品加工过程中的许多应激条件不敏感（在广泛的温度和pH范围内稳定）。它们的pH稳定性在较低温度下增加。噬菌体在食品工业的三个领域中使用：初级生产（主要用于防止设备表面生物膜的形成）、生物卫生（主要用于生产工厂）和生物保存（用于通过对抗腐败食品的病原细菌来延长产品保质期）。
在食品中使用噬菌体的成功取决于克服几个障碍。噬菌体数量是影响应用效果的重要因素。一般来说，噬菌体浓度越高，目标细菌的减少越显著。另一个障碍是使用的食品基质，它可能影响噬菌体的性能。液体基质允许更好的噬菌体扩散；然而，基质的特性仍然至关重要。在Zinno等人的研究中，将噬菌体应用于液体鸡蛋导致活性降低和噬菌体滴度下降，这被解释为基质的高粘度限制了噬菌体颗粒的扩散和均匀分布。噬菌体应用方法的选择也可能具有挑战性。噬菌体混合物以浸泡和喷洒产品的形式使用。噬菌体以微胶囊形式加入食品中，保护它们免受极端pH值和温度等不利环境因素的影响。
与噬菌体使用相关的有许多挑战，但可以通过仔细选择包含在生物制剂中的噬菌体来克服。其中一个问题是噬菌体抗性细菌的出现；因此，制造由几种不同噬菌体组成的混合物，具有尽可能广泛的抗菌活性谱，似乎是一种相关的方法。噬菌体可能携带毒力基因或抗生素抗性基因，但这些问题可以通过使用严格裂解性噬菌体来避免。还存在对噬菌体免疫原性和细胞毒性的担忧，这可能由目标细菌的裂解引起。
基于噬菌体的制剂在欧盟仍未被批准用于与食品直接接触。许多非欧盟国家，包括美国、巴西、荷兰、以色列、加拿大、瑞士、澳大利亚和新西兰，已允许在食品工业中使用噬菌体，众多公司提供专门用于食品工业的商业噬菌体生物制剂。许多制剂已获得FDA批准，如PhageGuard和USDA。十种商业噬菌体制剂获得了临时GRAS状态。2016年，EFSA发布了一份报告，确认了Micreos Food Safety的Listex P100对抗单核细胞增生李斯特菌的安全性和有效性，基于科学研究结果。
应强调，商业噬菌体制剂主要针对在食品环境中不占优势的病原细菌。在最低限度加工食品的情况下，一个重要问题是由于伴随腐生微生物群的发展导致产品质量下降，这通过腐烂、颜色和味道变差等方式造成产品腐败。食品中发现的腐生细菌也可能是抗生素抗性的储存库，可以传递给后续世代的细菌，包括构成消费者消化道微生物群的细菌。
因此，本研究的主要目标是评估噬菌体混合物在冷藏储存期间改善五种不同混合叶类沙拉的微生物学质量的有效性：芝麻菜、胡萝卜混合叶沙拉、甜菜根混合叶沙拉、清洗和未清洗的菠菜。首先，我们评估了选定的最低限度加工植物产品的总体微生物学质量，然后确定了食品产品中优势菌的抗生素耐药性谱。最后，使用新分离的特异性噬菌体制备噬菌体混合物，并评估其改善即食植物性食品产品微生物学质量的有效性。
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