材料与方法


细菌菌株、质粒和生长条件。本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表1。


表1：本研究中使用的细菌菌株和质粒
菌株或质粒 基因型或描述 来源或参考文献
菌株
S. maltophilia ATCC 13637 野生型菌株 CGMCC
E.coli DH5α 用于分子克隆的宿主菌株 实验室收藏
E. coli BL21(DE3) 用于蛋白质表达的宿主菌株 实验室收藏
SM004-SM055 (共51个菌株) D0107-04627 (共51个菌株)，通过pK18mob载体整合构建的嗜麦芽窄食单胞菌ATCC 13637组氨酸激酶基因插入突变体； Kanr 本研究
SM056 IFD-bfmA, bfmA (Smlt4209) 框内缺失突变体 本研究
SM057 IFD-bfmK, bfmK (Smlt4208) 框内缺失突变体 本研究
SM058 IFD-bfmA-bfmA, IFD-bfmA的互补菌株，含有pBBRMCS2:::bfmA载体； Kanr 本研究
SM059 IFD-bfmK-bfmK, IFD-bfmK的互补菌株，含有pBBRMCS2:::bfmK载体； Kanr 本研究
SM060 IFD-bfmA-bfmA*, 类似于SM059，但在bfmA的3'端带有His6编码序列，用于ChIP分析； Kanr 本研究
SM061 IFD-acoT, acoT (Smlt0800) 框内缺失突变体 本研究
SM062 IFD-acoT-acoT, IFD-acoT的互补菌株，含有pBBRMCS2::acoT载体； Kanr 本研究
SM063 IFD-bfmA-acoT, 含有pBBRMCS2::acoT载体的菌株IFD-bfmA，用于上位性分析； Kanr 本研究
质粒
pK18mob 通过单交换创建突变体的自杀载体； Kanr Schafer et al. (40)
pK18mobsacB 通过双交换创建突变体的自杀载体； Kanr Schafer et al. (40)
pET30a 蛋白质表达载体； Kanr Novagen
pBBR1MCS2 用于遗传互补的广宿主范围载体 实验室收藏
pBBR-4208 pBBR1MCS2::Smlt4208, bfmK突变体的遗传互补载体； Kanr 本研究
pBBR-4209 pBBR1MCS2::Smlt4209, bfmA突变体的遗传互补载体； Kanr 本研究
pBBR-0800 pBBR1MCS2::Smlt0800, acoT突变体的遗传互补载体； Kanr 本研究
pET30a-4209 pET30a:Smlt4209, 用于BfmA表达； Kanr 本研究
pET28a-4208 pET28a:::Smlt4208, 用于BfmK表达； Kanr 本研究
嗜麦芽窄食单胞菌ATCC 13637在28°C的NYG培养基（5克/升胰蛋白胨，3克/升酵母提取物，20克/升甘油；pH 7.0）中培养。嗜麦芽窄食单胞菌感受态细胞通过在210培养基（4克/升酪蛋白酶解物，5克/升蔗糖，3克/升K₂HPO₄，0.3克/升MgSO₄·7H₂O；pH 7.0）中培养细菌制备；细胞通过离心（12,000×g）收集，并用冰冰冷甘油（10%）洗涤三次。用于分子克隆的大肠杆菌DH5α细胞通常在37°C的Luria-Bertani培养基中培养。抗生素使用以下浓度：卡那霉素，50微克/毫升；氨苄青霉素，100微克/毫升；壮观霉素，100微克/毫升；链霉素，200微克/毫升。通过电穿孔（18和200Ω）使用Bio-Rad pulser Xcell电穿孔系统（Bio-Rad,USA）实现嗜麦芽窄食单胞菌和大肠杆菌的转化。



分子克隆和细菌菌株的遗传操作。使用自杀载体pK18mob和pK18mobsacB分别通过同源单交换方法和同源双交换方法构建嗜麦芽窄食单胞菌的插入失活突变体和框内缺失突变体，如前所述。用于扩增相关DNA序列的引物列于表2。插入失活突变体在含有卡那霉素的NYG平板上筛选，框内缺失突变体在含有10%蔗糖的NYG平板上筛选。为了构建点突变，根据产品手册使用Fast Mutagenesis System（Transgene,China）。常用的分子克隆方法，如PCR、连接和DNA限制性内切酶消化，按照《分子克隆：实验室手册》中的说明进行。

表2：本研究中使用的引物
引物 序列 (5'→3') 用途
IFD4208 GAATTCTGCGGAAGCCCTGGTGCA 构建bfmK框内缺失突变体
GGATCCGAGCCAGTCACTGGCACTGC
GGATCCATCGCCGAGGGCGACCGA
AAGCTTGATCAGGGCATGGTGCTTGG
C4208 AAGCTTATGCTGGCCCTGGCCAGC 用于bfmK互补
GAATTCTCAGGTGAACTTTCCCAGCAG
P4208 CCATGGATCTGGCCCTGGCCAGCCTG 用于BfmK表达
AAGCTTGGTGAACTTTCCCAGCAGCAG
H237A GCTGCAGTGGCGGCAGACCTGCGC 构建BfmK(H237A)
TGCCGCCACTGCAGCCAGCATATG
IFD4209 GAATTCGGAGAAATCGGAACGCCAGC 构建bfmA框内缺失突变体
GGATCCCAGCAGCACGTCCAGCGC
GGATCCGGGCAGGCCTCACCCGGT
AAGCTTTGCCCTGTGGTGGCGCAT
C4209 GGTACCATGACAACTCCCGCCCGT 用于bfmA互补
AAGCTTTCACAGCACCTGTACCTCGGC
P4209 CATATGACAACTCCCGCCCGTGTC 用于BfmA表达
AAGCTTCAGCACCTGTACCTCGGCG
D55A GACGTGATCATCATCCTCGCGTGGATGATG 构建BfmA(D55A)
CGCGAGGATGATCACGTCCGGGCGATC
His4209 GGTACCATGACAACTCCCGCCCGT 构建用于ChIP分析的菌株
AAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGCAGCACCTGTACCTCGGC
PR4209 CGGCAGGATGTGTTCGGGAG 用于EMSA，PSmlt4209探针
GCAGGCAGTATCAGGCAGG
IFD0800 AAGCTTATGCGCAAGACGGGATGG 构建acoT框内缺失突变体
GGATCCGGTTTTCGACTGCTGCCT
GGATCCGCCTATCGCCAGCGCCTGG
GAATTCTCAGAGCAGCGGCCTGAG
C0800 AAGCTTATGCGCAAGACGGGATGG 用于acoT突变体互补
GAATTCTCAGAGCAGCGGCCTGAG
P0800 CGATGGCCACGCTGGTGCCT 用于EMSA，PSmlt0800探针
TGGAGTCTCCTCATCGACAG
Q0570 GAAGTGGAGCTGGGCGAAAG 用于RT-PCR，Smlt0570
GGACGCATCGTCTGGATGTAC
Q0800 AAAAGCCGACCGTGGTAGTGA 用于RT-PCR，Smlt0800
GTTGGGCGGCACGTCAAT
Q0978 AACGCTGACCCGCGAAGT 用于RT-PCR，Smlt0978
TGGTCGTTGGCGAACACG
Q3568 GAGCTGCCGGACAAGATTGC 用于RT-PCR，Smlt3568
ATCCAGCACCAGATCGCCCACC
Q3949 ACCTGGGCAAACCATTCGA 用于RT-PCR，Smlt3949
TCCAGCAGCCGGTATTCG
Q4208 GCGGGTCGGTGTACTGAAGG 用于RT-PCR，bfmK
ATCGGCCAAGCGTCGTAG
Q4209 ATGACGACTCCCGCCCGT 用于RT-PCR，bfmA
CGACCTGCAGCAGCACGTC

表型表征。观察在NYG平板上培养24小时的细菌菌落形态。在丰富NYG培养基和有氧条件下的细菌生长通过自动化微生物生长曲线分析系统Bioscreen C（Oy Growth Curves Ab Ltd.,USA）测量。对于细菌游动性测定，将菌株用牙签接种到含有0.1%NYG的半固体琼脂中，并在28°C培养12小时，测量游动区的直径。对于生物膜定量，使用先前报道的结晶紫染色法。将嗜麦芽窄食单胞菌培养物定量接种到96孔聚苯乙烯板的NYG培养基中，板在28°C静置培养5小时。同时，通过酶标仪（Tecan Infinite 200 Pro）在600纳米波长下测量板中细菌生长的光密度值（OD₆₀₀）。在染色前用水冲洗板中的孔，然后用结晶紫（1%）染色20分钟，再冲洗。接着，用无水乙醇溶解结晶紫染色剂，并在酶标仪上测量590纳米波长下的生物膜量（n=8）。


RT-PCR和实时定量PCR测定。使用TRIzol（Invitrogen,USA）提取细菌总RNA，并用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher,USA）定量。接着，使用DNA-free DNase（Life Technologies）纯化提取的RNA以去除任何污染的DNA。使用随机引物（Promega,USA）和Superscript III逆转录酶（RT）（Invitrogen,USA）从纯化的RNA合成cDNA。包括嗜麦芽窄食单胞菌DNA模板作为PCR的阳性对照，转移信使RNA（tmRNA）扩增用作RT-PCR的加样对照；在cDNA合成过程中缺少逆转录酶的样品作为阴性对照，以评估潜在的DNA污染。用于扩采样基因的引物列于表2。


蛋白质表达、纯化和磷酸化测定。使用pET28a和pET30a（Novagen）表达载体分别在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中表达重组BfmA-His₆和BfmK-His₆蛋白。用于构建重组载体的PCR引物列于表2。BfmA-His₆通过Ni-次氮基三乙酸（NTA）亲和层析纯化，根据制造商手册（Novagen）。BfmK HK的反向膜囊泡根据我们先前研究中使用的方法制备。纯化的蛋白质和反向膜囊泡储存在储存缓冲液（50 mM Tris-HCl,0.5 mM EDTA,50 mM NaCl,5%甘油；pH 8.0）中。


我们按照先前使用的方法进行体外磷酸化测定。简而言之，对于自动磷酸化测定，将BfmK反向膜囊泡在20微升体积的自动磷酸化缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH 7.8],2 mM二硫苏糖醇[DTT],25 mM NaCl,25 mM KCl,5 mM MgCl₂）中与含有10微居里[γ-³²P]ATP（PerkinElmer）的100微摩尔ATP在28°C孵育10分钟。为了检测BfmK和BfmA之间的磷酸转移，将20微摩尔纯化的可溶性BfmA加入反应混合物中，然后在28°C孵育图4中指定的时间。通过加入6X SDS-PAGE上样缓冲液终止反应。然后将磷酸化的蛋白质在12%SDS-PAGE凝胶上分离。电泳后，将凝胶暴露于磷光成像屏1小时，并通过磷光成像系统（Amersham Biosciences）记录凝胶的放射性信号。


ChIP。染色质免疫沉淀（ChIP）方案遵循先前的研究。简而言之，将嗜麦芽窄食单胞菌在NYG培养基中培养至OD₆₀₀为0.4。用1%甲醛交联细胞，随后用0.5 M甘氨酸淬灭5分钟。通过离心收获的细菌培养物（4毫升）用10毫升冰冷的Tris缓冲盐水（TBS）缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH 7.5],150 mM NaCl）洗涤两次，然后重悬于1毫升裂解缓冲液（10 mM Tris[pH 8.0],20%蔗糖,50 mM NaCl,10 mM EDTA,10毫克/毫升溶菌酶）中。将IP缓冲液（50 mM HEPES-KOH[pH 7.5],150 mM NaCl,1 mM EDTA,1%Triton X-100,0.1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS,1 mM苯甲基磺酰氟）加入细菌细胞悬液中，并使用Diagenode Bioruptor UCD-300超声破碎仪（Diagenode,USA）对细胞进行超声处理，以产生平均约200 bp的DNA片段。离心后，用20微升蛋白A在4°C在慢速旋转器上预清除溶液10分钟，并保留100微升等分作为加样对照DNA（输入样品）。对于ChIP测定，将20微升蛋白A-琼脂糖珠（50%浆液）和2微升抗-His₆抗体加入800微升等分中，并在4°C与慢速旋转孵育过夜。第二天，通过离心收集珠子，并用IP缓冲液和洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl[pH 8.0],250 mM LiCl,1 mM EDTA,0.5%Nonidet P-40[相当于Triton X-114],0.5%脱氧胆酸钠）洗涤。通过加入100微升洗脱缓冲液（50 mM Tris[pH 7.5],10 mM EDTA,1%SDS）从珠子上洗脱免疫沉淀的染色质，并将溶液在65°C孵育10分钟。加入RNase A以去除RNA污染。使用蛋白酶K进行交联反转。使用PCR纯化试剂盒（Qiagen,USA）纯化DNA。对于半定量PCR，使用1微升洗脱的DNA和1微升对照DNA作为模板，用适当的引物进行PCR。捕获的DNA量归一化到对照输入DNA。


EMSA。对于电泳迁移率变动分析（EMSA），使用表2中所示的引物通过PCR扩增bfmA和acoT操纵子的启动子区域。使用T4多核苷酸激酶（New England Biolabs[NEB],USA）用[γ-³²P]ATP对PCR产物进行末端标记。将BfmA蛋白（1微克）和探针（4飞摩尔）在反应缓冲液[10 mM Tris(pH 7.0),50 mM KCl,1 mM DTT(pH 7.5),2.5%甘油,5微升MgCl₂,50纳克/微升poly(dI-dC),0.05%NP-40,和10 mM EDTA]中孵育20分钟。加入DNA上样缓冲液（0.25%溴酚蓝,40%蔗糖）终止反应，样品通过8%非变性PAGE分离。使用磷光成像屏检测放射性信号。不同浓度的未标记DNA探针用作竞争者。


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