最早的单细胞生长研究基于在恒温载物台上使用增稠培养基或琼脂平板对酿酒酵母和裂殖酵母的电影摄影分析。许多研究集中于酵母，因为其相对较大的尺寸和明确的形状，允许对单细胞进行可靠的尺寸和体积测量。更近期的研究还包括细菌菌株的调查和在微米结构中捕获细胞的分析。
关于生长异质性和细胞增殖一般特性的结果和结论存在分歧，部分相互矛盾。仔细查看这些研究期间应用的培养技术，揭示了一个可能对这些观察到的差异负责的共同特征。这些研究为单细胞的生长和增殖性质提供了有价值的见解，但所使用的培养技术缺乏适当的环境控制，可能影响了所做的观察。营养和氧气耗竭以及pH变化可能影响生理学，从而导致代谢网络功能和应激反应的显著改变，这肯定会导致生长行为的变化。细菌细胞的机械限制也被证明会导致变形和形态多样化。此外，细胞表面相互作用诱导的功能性变化和可能缺乏流体动力学刺激也不能排除。细胞表面相互作用触发的表型变化的一个特别重要的例子是生物膜形成，因为绝大多数微生物在生物膜中结合。
图3. 稀释群体比生长速率的频率分布。在30°C和低细胞密度范围1×10⁷细胞 mL⁻¹至2×10⁸细胞 mL⁻¹（600 nm处光密度约0.01至0.1）的指数生长期期间，确定毕赤酵母MutS（A）、多形汉逊酵母RB11Conphys（B）和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（C）的生长速率。y轴给出特定生长速率作为所有进行生长实验的分数的频率（毕赤酵母MutS，n=56；多形汉逊酵母RB11Conphys，n=63；谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，n=36）。比生长速率的密度函数遵循正态（高斯）分布（实线）。
然而，在微流控通道中培养的单细菌细胞生长稳健性的研究表明，在许多世代中长度增加速率非常稳定，这与我们的观察一致。最近一项研究报告了在单层生物反应器中限制的多达250个细胞的细菌微小菌落的生长速率增加。
通过使用Envirostat 2.0分析平台，本研究避免了所有提到的实验缺陷和由此产生的描述限制。然而，已描述了电场对微生物生长的不利影响。还表明，电场对生长的影响强烈依赖于施加的电压和频率，在低电压和高频率下影响减弱。由于本研究对介电泳捕获单个细胞应用了尽可能低的电压和尽可能高的频率，可以假设这些参数下的电场不影响或仅可忽略地影响微生物生理学。
因此，我们的研究表明，观察到的生长速率增加和稳健性与稳定的细胞外环境相关。
为了评估非均质环境对细胞生长的影响，将单细胞培养实验的动力学数据与摇瓶培养和稀释群体的生长动力学进行比较。在分批摇瓶培养过程中，细胞受到由营养物质的持续消耗和细胞外代谢物的产生引起的连续且剧烈的浓度变化。例如，含20 g L⁻¹葡萄糖的强缓冲培养基（100 mM邻苯二甲酸钾）的pH在分批培养多形汉逊酵母RB11Conphys的指数生长期结束时从7降至3.2。培养基组成变化引起的环境应激被认为反映在降低的生长速率中。此外，细胞外环境变化的程度应与活跃细胞数量相关，并随细胞浓度降低而减弱。
确实，与摇瓶实验相比，Envirostat 2.0中的单个细胞在体积增长方面表现出显著提升：毕赤酵母MutS菌株为48%，汉逊酵母RB11 Conphys菌株为120%，谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032菌株为32%。分离培养的细胞体积增长率也与稀释群体的生长速率进行了比较。假设稀释群体在极低细胞浓度下处于无限生长状态，因为少数细胞的代谢活动几乎不会改变环境组成。这一假设可通过测量稀释群体培养过程中培养基的pH值得到证实——该值未受细胞活性影响。
通过稀释至灭活法从单个细胞培养低细胞密度体系，揭示了存在稳定的生长表型，其生长行为偏离平均群体生长速率（表1）。稀释群体的生长实验在30°C条件下于100孔微孔板（芬兰Bioscreen C MBR 全自动微生物生长曲线分析仪）中进行，所用培养基与单细胞实验相同。所有测试微生物细胞在极低生物量浓度下的生长分析中均显示出比标准摇瓶培养更高的比生长速率。
稀释菌群的平均比生长速率测定结果分别为：毕赤酵母MutS株为0.27 h⁻¹、汉逊酵母RB11 Conphys株为0.34 h⁻¹、谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032株为0.48 h⁻¹，分别对应生长速率提升幅度达17%、61%和9%。这种生长增强现象很可能归因于相较于摇瓶培养体系中营养物质与氧气的更充足供应，以及低细胞密度培养条件下培养基成分的微小变化。由单个细胞培养获得的稀释菌群生长速率分布呈正态分布，其观测值范围显著宽于单细胞培养体系（图3）。生长速率的广泛分布可能源于单个接种细胞所携带的生长特性遗传特征，这些特性决定了菌群在非均质环境中持续繁殖的能力。
当比较低生物质浓度和高生物质浓度培养的单细胞实验结果时，单细胞始终较高的比生长速率令人瞩目。在Envirostat 2.0系统中培养时，毕赤酵母MutS和多形汉逊酵母RB11Conphys的单个细胞平均体积生长速率分别比稀释群体高1.26倍和1.35倍。谷氨酸棒杆菌ATCC 13032单个细胞的体积生长超过稀释群体比生长速率的1.21倍。
据我们所知，这是在受控环境和无接触细胞操作下单细胞水平微生物生长的首次系统研究。
总之，我们的结果表明，尽管克隆群体中存在细胞间差异，但这些固有差异在受控培养条件下并未表现为可变的生长速率。相反，是细胞外环境可以决定有效的最大生长速率。这一原则被证明对两种单细胞微生物真核生物和一种原核生物有效。
本研究展示了在单细胞水平上阐明细胞生理学及其对扰动的反应的益处，不受细胞外环境和群体平均的不可控变化的影响。
致谢
我们感谢莱布尼茨研究生院-系统生物学芯片实验室（S-BLOC）的资助。该研究由欧盟（EFRE）共同资助，并得到北莱茵-威斯特法伦州创新、科学、研究和技术部的支持。
多形汉逊酵母RB11Conphys由M. Piontek（ARTES Biotechnology，Langenfeld，德国）慷慨提供。
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