3. 结果与讨论

3.1 测试的最低限度加工植物性食品产品的微生物学质量评估

本研究旨在评估最低限度加工植物性食品产品的微生物学质量及其在冷藏储存期间的变化。在保质期内和到期后2天确定的特定微生物群数量的变化总结于表1。

表1. 冷藏储存期间测试的最低限度加工植物性食品产品的微生物学质量

产品微生物质量 x±SD[log CFU g⁻¹]
微生物分析	芝麻菜		混合叶沙拉配胡萝卜		混合叶沙拉配甜菜根		已清洗菠菜		未清洗菠菜
	保质期内	过期后	保质期内	过期后	保质期内	过期后	保质期内	过期后	保质期内	过期后
嗜冷和/或嗜冷营养微生物总数	7.14±0.37ᵇ	9.45±0.45ᵃ	7.35±0.39ᵇ	8.54±0.27ᵃ	7.34±0.05ᵇ	8.52±0.11ᵃ	7.61±0.52ᵇ	9.06±0.40ᵃ	6.29±0.05ᵇ	8.05±0.11ᵃ
嗜温微生物总数	7.59±0.59ᵇ	9.84±0.88ᵃ	7.38±0.42ᵇ	8.58±0.24ᵃ	7.29±0.10ᵇ	8.58±0.01ᵃ	7.56±0.53ᵇ	9.07±0.42ᵃ	10.10±0.04ᵇ	10.41±0.06ᵃ
产酸菌数量	5.42±0.61ᵇ	7.09±0.02ᵃ	6.20±1.21ᵃ	7.70±0.36ᵃ	5.17±0.89ᵇ	7.56±0.35	5.44±0.23ᵃ	6.42±0.59ᵃ	5.98±0.15ᵇ	9.84±0.05ᵃ
大肠菌群数量	5.57±0.37ᵇ	6.91±0.31ᵃ	6.18±0.57ᵃ	7.19±0.35ᵃ	5.75±0.10ᵇ	7.34±0.18ᵃ	5.98±0.51ᵃ	6.65±0.54ᵃ	4.20±0.19ᵇ	6.22±0.07ᵃ
肠杆菌科细菌数量	5.98±0.20ᵇ	6.96±0.37ᵃ	6.26±0.51	7.28±0.34ᵃ	5.94±0.10	7.56±0.11ᵃ	6.31±0.08ᵃ	6.97±0.70ᵃ	5.32±0.09ᵇ	5.98±0.06ᵃ

小写字母表示p<0.05时的显著差异（n=3）。缩写：芝麻菜；胡萝卜混合叶沙拉；甜菜根混合叶沙拉；清洗菠菜；未清洗菠菜；保质期前；到期后。

所有测试的即食食品产品都具有高数量的嗜冷和/或嗜冷腐生微生物。这些微生物表现出活跃的代谢并活跃繁殖。一般来说，到期日后两天，与保质期内分析的样品相比，污染水平平均增加1-2 log单位。在分析的产品中，芝麻菜的微生物学稳定性最差。其嗜冷和/或嗜冷微生物污染水平增加了2 log单位，从7.14±0.37 log CFU g⁻¹（保质期前）增加到9.45±0.45 log CFU g⁻¹（到期后）。在保质期（保质期前）内，未清洗菠菜中嗜冷和/或嗜冷微生物水平最低（6.29±0.05 log CFU g⁻¹），清洗菠菜中最高（7.61±0.52 log CFU g⁻¹）。嗜温微生物的数量，如同嗜冷和/或嗜冷微生物一样，在冷藏储存期间平均增加1-2 log单位（到期后）。微生物学稳定性最差的是芝麻菜，其污染从7.59±0.59 log CFU g⁻¹（保质期前）增加到9.84±0.88 log CFU g⁻¹（到期后），增加了2 log单位。保质期（保质期前）内，未清洗菠菜的特征是嗜温微生物污染水平最高。作为唯一一种不打算供消费者直接食用的测试产品（由于生产过程中省略了清洗阶段）。在冷藏储存期间，嗜温水平从10.10±0.04 log CFU g⁻¹（保质期前）增加到10.41±0.06 log CFU g⁻¹（到期后）。高微生物污染水平表明生产过程中产品清洗不足。污染水平与原材料的初始微生物组成直接相关，批次之间有所不同。波兰立法没有规定植物来源最低限度加工产品中腐生微生物污染的可接受水平。考虑到其他欧盟国家（如法国或德国）的标准，其中允许水平为5.0×10⁷ CFU mL⁻¹，应注意所有测试产品（在保质期内）在嗜冷和/或嗜冷微生物和嗜温微生物方面均符合此要求，除清洗菠菜外。到期后，没有一种分析产品符合此标准。

在Michalczyk和Macura关于叶类蔬菜微生物学质量的研究中，发现德国和法国推荐的嗜冷和/或嗜冷微生物总数标准被超过。芝麻菜在分析第一天已含有10⁸ CFU g⁻¹的这些微生物，在冷藏储存期间其数量略有增加。关于冰山生菜，嗜冷和/或嗜冷微生物水平从10⁵ CFU g⁻¹增加到10⁸ CFU g⁻¹。在Maffei等人的研究中，叶类蔬菜的嗜温微生物污染与我们的研究中保质期产品的测试结果相当，范围为10⁶ CFU g⁻¹至10⁷ CFU g⁻¹。在Abadias等人的研究中，清洗菠菜和生菜中嗜温微生物的污染水平也与我们的研究结果相当，分别为10⁷和10⁶ CFU g⁻¹。

研究的另一组微生物是产酸细菌，其数量在冷藏储存期间每种产品平均增加1至4 log单位。在胡萝卜混合叶沙拉和清洗菠菜中，到期日前后产酸细菌数量未发现显著差异。在保质期（保质期前）内，胡萝卜混合叶沙拉中产酸细菌水平最高（6.20±1.21 log CFU g⁻¹），甜菜根混合叶沙拉中最低（5.17±0.89 log CFU g⁻¹）。在冷藏储存期间，未清洗菠菜中产酸细菌水平增加最多，从5.98±0.15 log CFU g⁻¹（保质期前）增加到9.84±0.05 log CFU g⁻¹（到期后）。与清洗菠菜相比，未清洗菠菜的特征是产酸细菌水平更高。在Abadias等人的研究中，产酸细菌污染水平低于我们研究中规定的水平，菠菜为10⁵ CFU g⁻¹，生菜为10⁴ CFU g⁻¹。

在保质期（保质期前）内，胡萝卜混合叶沙拉中大肠杆菌群细菌水平最高（6.18±0.57 log CFU g⁻¹），未清洗菠菜中最低（4.20±0.19 log CFU g⁻¹）。在胡萝卜混合叶沙拉和清洗菠菜中，到期日前后产酸细菌数量未发现显著差异。高大肠杆菌群细菌水平可能表明农田使用天然肥料施肥，且在生产过程中未从原材料表面充分去除。在冷藏储存期间，乳糖阳性杆菌水平平均增加1-2 log单位。

在保质期（保质期前）内，清洗菠菜和胡萝卜混合叶沙拉含有最高数量的肠杆菌科细菌（分别为6.31±0.08 log CFU g⁻¹和6.26±0.51 log CFU g⁻¹）。未清洗菠菜中污染最低（5.32±0.09 log CFU g⁻¹），在冷藏储存期间（到期后），肠杆菌科水平增加到5.98±0.06 log CFU g⁻¹。在其余产品中，冷藏储存期间肠杆菌科细菌数量增加1-2 log单位；然而，在清洗菠菜储存期间未观察到该组细菌的显著增长。在Abadias等人的研究中，芝麻菜和菠菜中肠杆菌科水平分别为5.3 log CFU g⁻¹和6.0 log CFU g⁻¹。生菜中肠杆菌科水平低得多（4.4 log CFU g⁻¹）。在Michalczyk和Macura进行的冰山生菜研究中，储存期间肠杆菌科细菌污染水平为10⁴ CFU g⁻¹至10⁶ CFU g⁻¹。

在任何测试食品产品中均未发现病原性大肠杆菌O157:H7。1 g食品样品中未检出凝固酶阳性葡萄球菌。25 g食品产品中未检出沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。仅从胡萝卜混合叶沙拉中分离出其他属于李斯特菌属的细菌。在每个即食食品产品中，分离出乳糖阳性肠杆菌属或阪崎克罗诺杆菌。

3.2 分离细菌菌株的分类学鉴定

基于评估的产品微生物学质量，决定寻找针对肠杆菌科优势菌的噬菌体。为此，分离了宿主细菌菌株的纯培养物，并通过分子方法（16S rRNA基因区域扩增）或蛋白质组学谱分析（使用MALDI-TOF-MS）确认了所有菌株的分类学归属。所有菌株的核苷酸序列已存入GenBank数据库（表2）。本研究后续阶段分离出特异性噬菌体的细菌菌株包含在表2中。

表2. 细菌的来源和分类学鉴定

细菌菌株编号	菌株保藏号	分离来源	MALDI-TOF MS鉴定	16S rRNA测序鉴定	GenBank登录号
RUC-08	KKP 3706	芝麻菜	肠杆菌属	阴沟肠杆菌	OM278533
RUC-09	KKP 3655	芝麻菜	弗氏柠檬酸杆菌	弗氏柠檬酸杆菌	MZ827001
RUC-10	KKP 3800	芝麻菜	大肠杆菌	大肠杆菌	OM250392
RUC-11	KKP 3801	芝麻菜	大肠杆菌	大肠杆菌	OM250391
RUC-16	KKP 3825	芝麻菜	大肠杆菌	大肠杆菌	ON303626
RUC-17	KKP 3651	芝麻菜	成团泛菌	成团泛菌	OP978292
MLSC-01	KKP 3889	混合叶沙拉配胡萝卜	液化沙雷氏菌	液化沙雷氏菌	OP999699
MLSC-02	KKP 575	混合叶沙拉配胡萝卜	肠杆菌属	阴沟肠杆菌	OP935700
MLSC-10	KKP 1384	混合叶沙拉配胡萝卜	水生拉恩氏菌	水生拉恩氏菌	OP935751
MLSC-11	KKP 3082	混合叶沙拉配胡萝卜	肠杆菌属	阴沟肠杆菌	MZ827006
MLSC-13	KKP 3687	混合叶沙拉配胡萝卜	粘质沙雷氏菌	粘质沙雷氏菌	OK103977
MLSC-16	KKP 3824	混合叶沙拉配胡萝卜	大肠杆菌	大肠杆菌	ON303636
MLSC-17	KKP 591	混合叶沙拉配胡萝卜	液化沙雷氏菌	液化沙雷氏菌	OP935744
MLSC-21	KKP 3083	混合叶沙拉配胡萝卜	产酸克雷伯氏菌	路德维希肠杆菌	MZ827002
MLSC-22	KKP 590	混合叶沙拉配胡萝卜	成团泛菌	成团泛菌	OP935743
MLSB-04	KKP 3084	混合叶沙拉配甜菜根	居泉沙雷氏菌	居泉沙雷氏菌	MZ827668
MLSB-07	KKP 589	混合叶沙拉配甜菜根	成团泛菌	成团泛菌	OP935741
MLSB-09	KKP 1383	混合叶沙拉配甜菜根	水生拉恩氏菌	水生拉恩氏菌	OP935750
MLSB-10	KKP 3654	混合叶沙拉配甜菜根	液化沙雷氏菌	液化沙雷氏菌	OP978313
MLSB-12	KKP 357	混合叶沙拉配甜菜根	粘质沙雷氏菌	粘质沙雷氏菌	OP935680
MLSB-14	KKP 3688	混合叶沙拉配甜菜根	大肠杆菌	大肠杆菌	OM281784
MLSB-10	KKP 3705	混合叶沙拉配甜菜根	大肠杆菌	大肠杆菌	OM212647
MLSB-18	KKP 581	混合叶沙拉配甜菜根	柠檬酸杆菌属	柠檬酸杆菌属	OP935699
MLSB-19	KKP 585	混合叶沙拉配甜菜根	粘质沙雷氏菌	粘质沙雷氏菌	OP935711
MLSB-21	KKP 3650	混合叶沙拉配甜菜根	大肠杆菌	大肠杆菌	OM287487
MLSB-22	KKP 3689	混合叶沙拉配甜菜根	土生拉乌尔菌	土生拉乌尔菌	OK085529
MLSB-23	KKP 584	混合叶沙拉配甜菜根	成团泛菌	成团泛菌	OP935688
MLSB-25	KKP 3684	混合叶沙拉配甜菜根	肠杆菌属	阴沟肠杆菌	OM281790
WSP-05	KKP 3685	已清洗菠菜	居泉沙雷氏菌	居泉沙雷氏菌	OM281802
WSP-06	KKP 3652	已清洗菠菜	居泉沙雷氏菌	居泉沙雷氏菌	OM287486
WSP-07	KKP 3686	已清洗菠菜	肠杆菌属	阴沟肠杆菌	OM281778
WSP-09	KKP 3802	已清洗菠菜	大肠杆菌	大肠杆菌	OM250393
WSP-19	KKP 3707	已清洗菠菜	大肠杆菌	大肠杆菌	OM281777
WSP-25	KKP 3691	已清洗菠菜	大肠杆菌	大肠杆菌	OM281773
UWSP-07	KKP 3692	未清洗菠菜	阴沟肠杆菌	阴沟肠杆菌	OM281803
UWSP-08	KKP 3887	未清洗菠菜	成团泛菌	成团泛菌	OP999723
UWSP-20	KKP 3892	未清洗菠菜	肠杆菌属	肠杆菌属	OP999695
UWSP-23	KKP 3656	未清洗菠菜	阴沟肠杆菌	阴沟肠杆菌	OM304355
UWSP-30	KKP 3888	未清洗菠菜	成团泛菌	成团泛菌	OQ001073
UWSP-33	KKP 3891	未清洗菠菜	肠杆菌属	肠杆菌属	OP999696
UWSP-36	KKP 3890	未清洗菠菜	液化沙雷氏菌	液化沙雷氏菌	OP999702
UWSP-37	KKP 671	未清洗菠菜	粘质沙雷氏菌	粘质沙雷氏菌	OP935745
UWSP-40	KKP 1218	未清洗菠菜	水生拉恩氏菌	水生拉恩氏菌	OP935749

缩写：芝麻菜；胡萝卜混合叶沙拉；甜菜根混合叶沙拉；清洗菠菜；未清洗菠菜。

共发现43株噬菌体，其中6株、9株、13株、6株和9株分别特异性针对从芝麻菜、胡萝卜混合叶沙拉、甜菜根混合叶沙拉、清洗菠菜和未清洗菠菜中分离的细菌。分离的细菌属于肠杆菌目三个科的七个属：肠杆菌属（10株）、大肠杆菌属（10株）、柠檬酸杆菌属（2株）和拉乌尔氏菌属（1株）来自肠杆菌科；沙雷氏菌属（11株）和拉恩氏菌属（3株）来自耶尔森菌科；成团泛菌属（6株）来自欧文菌科。

大多数细菌菌株的遗传鉴定（16S rRNA扩增）与蛋白质组学鉴定一致。对于三株菌株（柠檬酸杆菌属KKP 581、肠杆菌属KKP 3891和肠杆菌属KKP 3892），遗传鉴定仅允许将细菌分离株分类到属水平。这可能与属于柠檬酸杆菌属和肠杆菌属的菌株之间的密切系统发育关系有关。此外，关于路德维希肠杆菌KKP 3083菌株，基于MALTI-TOF-MS的蛋白质组学鉴定将该菌株分类为产酸克雷伯氏菌（但仅84.4%的匹配度，这可能影响了这种鉴定结果）。同样，对于几株分离株，MALDI-TOF-MS分析仅将菌株分类到属水平。这可能与产品加工技术有关（例如，在食品处理过程中，细菌细胞可能受损，这可能影响基于蛋白质谱的鉴定结果）。此外，MALDI-TOF-MS分析主要基于面向医疗行业的数据库的蛋白质谱，医疗分离株可能与从食品产品中分离的分离株有很大不同。

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