1.2.5菌液CFU与OD600nm值相关性分析
将菌种按照0.1%的接种量接种于液体培养基中，于37℃、220r/min振荡培养8h。使用无菌PBS调零在波长为600nm时测量菌液的OD值(重复3次取平均值)，将剩余菌液重悬，用PBS进行2、4、6、8、10倍稀释，无菌PBS调零，测稀释后菌液的OD600nm值。对稀释后的菌液分别进行10⁴稀释，稀释过程中使用旋涡混合仪进行充分振荡、混匀。将各组稀释菌液分别吸取1mL至LB固体培养基中，摇晃使其充分铺满皿底，37℃培养12h，分组计数(重复3次取平均值)。采用MicrosoftExcel2007进行数据统计分许，绘制OD值与活菌数的线性关系。
1.2.6弗格森埃希菌对昆明小鼠LD₁₀₀和LD₁的确定
弗格森埃希菌对昆明小鼠LD₁₀₀和LD₁的确定：以5只昆明小鼠为一组，腹腔注射菌液0.3mL，其活菌量为1.3122×10⁸CFU(预试验估计的LD₁₀₀)，并记录下7d内昆明小鼠死亡情况，如果全部都死亡，则剂量减少1×10⁸CFU，若有昆明小鼠2只或2只以上存活，则菌量増加1×10⁸CFU，直至找到此剂量相邻的高剂量即为LD₁₀₀。同法给另一组昆明小鼠注射活菌量为1.17×10⁷CFU的弗格森埃希菌的LD₁。根据上诉方法测得的LD₁₀₀只有LD₁。根据上述方法而与此剂量相邻的低剂量即为LD₁。
1.2.7试验各组细菌剂量的确定
将昆明小鼠随机分组，每组5只。各组细菌剂量要按等比级数排列，按下公式求出公比r：r=(G/n)√Dm/D1(G为组数，Dm/Dn为LD₁₀₀与LD₁之比)。由上述公式求得：r=1.83，那么试验各组剂量：D1=LD₁，D2=D1×r，D3=2×D3=D3=D4=D4，由此计算出试验5个组的菌量分别为1.17×10⁷、2.141×10⁷、3.918×10⁷、7.17×10⁷、1.3122×10⁸CFU。试验组组细菌菌量的确定将昆明小鼠随机按下列公式排出公比r：r=(G/n)√Dm/D1(G为组数，Dm/Dn为LD₁₀₀与LD₁之比)。由上述公式求得：r=1.83，那么试验各组剂量：D1=LD₁，D2=D1×r，D3=D3×r=D3=D4=D4，由此计算出试验5个组的菌量分别为1.17×10⁷、2.141×10⁷、3.918×10⁷、7.17×10⁷、1.3122×10⁸CFU。
试验组组细菌菌量的确定将昆明小鼠随机按下列公式排出公比r：r=(G/n)√Dm/D1(G为组数，Dm/Dn为LD₁₀₀与LD₁之比)。由上述公式求得：r=1.83，那么试验各组剂量：D1=LD₁，D2=D1×r，D3=D3×r=D3=D4=D4，由此计算出试验5个组的菌量分别为1.17×10⁷、2.141×10⁷、3.918×10⁷、7.17×10⁷、1.3122×10⁸CFU。试验时，对照组腹腔注射等量的无菌PBS，注射后将昆明小鼠放回原笼中自由采食、饮水，密切观察小鼠的死亡情况，并记录试验结果。
1.2.8弗格森埃希菌对昆明小鼠LD₅₀计算
应用SPSS软件对各组注射剂量、动物数、动物死亡数进行数据分析计算LD₅₀以及95%置信区间。
2结果
2.116SrDNAPCR扩增
以菌体DNA为模板进行PCR扩增，结果显示在1500bp左右存在目的条带，与预期结果相符(图1)。
图116SrDNAPCR扩增结果
2.2同源性分析
将该菌体DNA委托擎科生物有限公司进行测序，将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结果显示，菌株DNA与弗格森埃希菌Y53(登录号：MK561308.1)同源性为99.93%。从GenBank中筛选相关模式菌株16SrDNA序列，将软件序列与标准株相关序列进行DNA比对，利用DNASTAR构建遗传进化树(图2)，结果显示，本试验使用的弗格森埃希菌JL与弗格森埃希菌Y53菌株亲缘关系最近。
图2遗传进化树构建结果
图3弗格森埃希菌生长曲线
2.3弗格森埃希菌生长曲线的测定
振荡比浊法测定弗格森埃希菌生长曲线(图3)，结果显示，弗格森埃希菌在培养4h后OD600nm值迅速上升，12h到达最大值，表明弗格森埃希菌处于对数生长期。12h之后曲线趋于平稳，进入稳定期。
2.4弗格森埃希菌OD600nm值与菌液稀释倍数的关系
将培养至对数生长期的弗格森埃希菌进行稀释并测定OD600nm值，绘制弗格森埃希菌OD600nm值与菌液稀释倍数的关系(图4)。结果显示，弗格森埃希菌OD600nm值与菌液稀释倍数关系表达式为：y=-0.577ln(x)+1.5896,R²=0.9965，具有良好的相关性。
图4弗格森埃希菌OD600nm值与菌液稀释倍数的关系
2.5菌液CFU与OD600nm值相关性分析
以OD600nm值为横坐标，活菌数为纵坐标绘制不同吸光度下两者之间的回归曲线(图5)。结果显示，弗格森埃希菌的OD600nm值与活菌数表现出良好的相关性(R²=0.9955)。
图5弗格森埃希菌OD600nm值与活菌数的关系
2.6LD₅₀测定结果
小鼠接种弗格森埃希菌4h左右开始出现精神萎靡、扎堆等临床症状，5d内陆续死亡。各组注射菌量、小鼠数和死亡数见表1。经SPSS软件分析，计算LD₅₀及95%置信区间结果见表2。结果表明，弗格森埃希菌小鼠半数致死量LD₅₀为2.944×10⁷CFU，95%置信区间为1.557×10⁶～4.817×10⁷CFU。
表1各组注射菌量与小鼠死亡统计
| 分组 Groups | 注射菌量 Injection volume (×10⁷ CFU) | 动物数 Animal number | 死亡数 Death number | 死亡率/% Mortality |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 1.17 | 10 | 0 | 0 |
| 2 | 2.141 | 10 | 4 | 40 |
| 3 | 3.918 | 10 | 8 | 80 |
| 4 | 7.17 | 10 | 8 | 80 |
| 5 | 13.122 | 10 | 10 | 100 |
表2小鼠半数致死量LD₅₀及95%置信区间
| 项目 Item | 95%置信区间 (×10⁷ CFU) | log95%置信区间 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 估计 Estimate | 下限 Lower limit | 上限 Superior limit | 估计 Estimate | 下限 Lower limit | 上限 Superior limit | |
| 半数致死量(LD₅₀) | 2.944 | 1.557 | 4.817 | 7.469 | 7.192 | 7.683 |
3讨论
16SrDNA是细菌的系统分类研究中最常用的分子钟，在结构和功能上具有高度的保守性的同时也能区分出不同菌种间的差异。本试验利用细菌的16SrDNA鉴定，对菌株进行基因水平上的分类，结果显示，本试验研究的菌株与弗格森埃希菌的同源性为99.93%。生长曲线的测定方法包括血球计数板法、平板菌落计数法(CFU)、称重法和振荡比浊法(D值法)，CFU法操作准确，但耗时，易受操作误差影响；D值法结果简单，误差小，OD600nm值法是通过测定菌液的吸光度来判断细菌增长的速度，不能区分活菌和死菌，因此，该法只能得出该菌各生长阶段的大概时间。本试验对弗格森埃希菌的生长曲线和半数致死量进行了补充研究，通过绘制弗格森埃希菌的生长曲线，以0.1%的接种量接种在LB液体培养基中培养4h～12h为对数生长期，在培养12h之后进入稳定期。取对数生长期的菌液绘制菌液OD600nm值与菌液稀释倍数的关系，得到关系式：y=-0.577ln(x)+1.5896,R²=0.9965，具有良好的相关性；通过OD600nm值与活菌数的函数关系，得到关系式：y₂=11.09x+0.1577,R²=0.9955，通过这两个关系式可准确地计算出不同OD600nm值对应的活菌数，为弗格森埃希菌对不同小鼠半数致死量的研究提供了可靠依据。SPSS软件可简便、快速、直观地得到费格森埃希菌LD₅₀及95%置信区间，并且计算结果与用改良寇氏法计算的结果无显著性差异。
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