摘要
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在工业发酵时面临的噬菌体污染是行业难题。以饲料中常用的枯草芽孢杆菌K28为宿主分离得到一株裂解性噬菌体PJNB028，对其进行了生物学特性测定、全基因组注释和系统进化分析和抗性菌筛选。PJNB028可在宿主菌平板形成圆形、透亮、边缘清晰且有晕环的噬菌斑。PJNB028携带162 308 bp的线性双链DNA，G+C含量为34%，含有237个开放阅读框(open reading frame，ORF)，属于Caudoviricetes纲。最佳感染复数(MOI)为1，较为耐酸不耐碱(pH 3~11)，对紫外线较敏感;PJNB028的潜伏期为10 min，爆发期为70 min，爆发量为291 PFU/cell;在70~80℃高温下处理1 h效价明显降低，37℃作用8 h噬菌体对枯草芽孢杆菌繁殖体具有良好的抑菌效果。PJNB028能裂解莫哈韦芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等50%(n=20)的芽孢杆菌。通过噬菌体与宿主菌共培养筛选出3株抗性菌株，部分抗性菌株在发酵中表现出更高的α-淀粉酶活性及菌株效价。根据PJNB028生物学特性和基因组分析，可使用抗性菌株或结合热碱液、高温灭菌和紫外线消毒等防控噬菌体，为以后防治芽孢杆菌噬菌体污染提供了可靠的研究素材。
枯草芽孢杆菌是一种广泛存于自然环境的好氧杆状革兰氏阳性菌，具有抑菌、耐酸、耐高温和耐胆盐等益生特性。枯草芽孢杆菌在工业微生物领域具有较高的应用价值，是国际上公认的益生菌，只有单层细胞外膜，能将蛋白质分泌到培养基中，合成多种酶、核苷酸及抗生素等多种有机大分子物质，是多种酶类的理想原核表达宿主。枯草芽孢杆菌所需营养物质简单，作为饲料添加剂能有效改善肠道菌群结构平衡。
噬菌体是感染细菌、真菌的病毒，分布十分广泛，在治疗临床多重耐药病原菌、控制加工食品致病菌的应用上具有巨大潜力。了解噬菌体的生物学特性，通过对其侵染和裂解机制的研究，筛选抗噬菌体菌株发酵生产枯草芽孢杆菌，是防止枯草芽孢杆菌在发酵过程中被噬菌体污染的必要环节。
早在1961年，研究者们就开发了一种直接分离枯草芽孢杆菌噬菌体的简化程序。近年来，枯草芽孢杆菌噬菌体的多样性逐渐被开发，已鉴定的最小裂解性噬菌体vB_BsuP-Goe1，基因组仅18 379 bp;裂解噬菌体φ29是研究病毒DNA包装、复制和转录等过程的模型。通过观察枯草芽孢杆菌感染噬菌体，研究者首次提供了噬菌体吸附和将基因组转移到革兰氏阳性菌结构变化的可视化，将枯草芽孢杆菌噬菌体建立为模型系统可能有助于更好地了解炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等的噬菌体。
枯草芽孢杆菌噬菌体在食品工业中备受关注，一方面它可能会阻碍细菌发酵从而造成经济损失，如其在韩国大豆发酵中暴发的普遍性高。另一方面，噬菌体疗法能靶向清除细菌生物膜，从而降低食源性疾病风险，这种生物控制策略在食品加工中是一项新的“绿色”技术。
本研究以枯草芽孢杆菌为宿主，分离得到了一株枯草芽孢杆菌噬菌体PJNB028，对其生物学特性和基因组特性进行了研究和分析，为枯草芽孢杆菌发酵污染防控提供研究素材。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1宿主菌与噬菌体来源
枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和莫哈韦芽孢杆菌等由实验室分离保存，采用双层平板法从土壤浸出液中分离噬菌体，纯化后的噬菌体与60%甘油1∶1混合后置于-80℃长期保存。
1.1.2主要试剂和仪器
LB培养基中的胰蛋白胨和酵母粉购自赛默飞世尔科技公司，氯化钠(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司，琼脂购自北京索莱宝科技有限公司;PCR仪购自赛默飞世尔科技公司;超速离心机购自湘仪离心机仪器有限公司;水浴锅购自上海精宏实验设备有限公司;动态吸收光酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。
1.2方法
1.2.1噬菌体分离与纯化
将10 g土壤和20 mL蒸馏水混合，12 000×g离心10 min，使用0.22μm无菌滤膜过滤上清液后，双层琼脂平板法检测滤液中噬菌体。取100μL枯草芽孢杆菌菌液和500μL污水滤液在5 mL EP管混匀，加入50℃LB半固体(按体积加入0.6%琼脂粉)培养基，快速颠倒混匀倒在事先准备好的LB琼脂底板上，待上层半固体凝固后放入37℃培养箱培养6~12 h，肉眼观察噬菌斑形态及大小。
挑取单个噬菌斑放入10μL SM液吹打均匀，100μL菌液和4 mL 50℃LB半固体培养基混合倒入LB底板，待上层琼脂凝固后点斑，置于37℃培养箱中待噬菌体长出后挑取单个噬菌斑扩培，重复5次以上至平板上存在大小形态比较一致的噬菌斑，挑取单个噬菌斑接入处于对数期的宿主菌菌液中，培养至菌液澄清后过滤，4℃保存。
1.2.2噬菌体基因组分析
使用OMEGA病毒DNA试剂盒提取噬菌体DNA，送至北京擎科生物科技有限公司进行全基因组测序。使用SPAdes软件进行序列拼接。将拼接完成的全基因组序列提交至NCBI网站进行同源比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。使用在线平台RAST(https://rast.nmpdr.org)进行功能预测，获得噬菌体的全基因组注释信息，将其氨基酸序列逐一使用blast在线blastp工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进一步对预测的基因进行注释。使用SnapGene软件绘制整个噬菌体基因组。使用tRNAscan-SE(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)搜索tRNA序列，用CARD数据库(https://card.mcmaster.ca/analyze/blast)识别毒力基因和耐药基因，使用MEGA5.0软件绘制全基因组进化树和末端酶大亚基进化树。
1.2.3最佳感染复数测定
将培养至对数期的宿主菌按5%接种量加入10 mL LB液体培养基中，于37℃摇床中180 r/min振荡培养4 h后取出进行效价测定，将保存的噬菌体原液测效价后梯度稀释，按照感染复数(MOI)为10μL、1μL、0.1μL、0.01μL、0.001μL将100μL噬菌体液和100μL对数期枯草芽孢杆菌菌液进行混合，加入4.8 mL LB液体培养基放入细菌瓶培养2 h后，12 000×g离心10 min，上清液用0.22μm滤器过滤，使用双层平板法测定不同MOI的噬菌体效价。通过计算得出最佳MOI。试验重复3次。
1.2.4一步生长曲线测定
将噬菌体液与宿主菌菌液按最佳MOI混合，于温箱37℃静置10 min进行噬菌体吸附。10 000×g离心1 min，弃上清液并用LB液体培养基将沉淀重悬，加入37℃提前预热的10 mL LB液体培养基充分混匀，置于37℃摇床中180 r/min培养。同时开始计时，在0 min和每隔10 min时取样，12 000×g离心2 min，测定上清液中噬菌体效价，每组重复3次，绘制一步生长曲线。
1.2.5噬菌体温度稳定性测定
取噬菌体原液各1 mL置于不同温度(37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)的水浴锅中处理30 min、60 min后，通过双层琼脂平板法测定效价。试验重复3次。
1.2.6噬菌体保存pH稳定性测定
将SM缓冲液pH调整为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12并高压灭菌，将100μL噬菌体液置于不同pH的SM缓冲液中，置于37℃摇床孵育1 h后，12 000×g离心10 min收集上清液，测定噬菌体效价，不同pH重复3次。