摘要：为测定弗格森埃希菌半数致死量,采用BioscreenC°PRO全自动微生物生长曲线分析仪&振荡比浊法(Dλ值法)测定弗格森埃希菌的生长曲线,并确定菌液与稀释倍数的关系,利用SPSS软件计算弗格森埃希菌对昆明小鼠的半数致死量(LD50)。结果显示,弗格森埃希菌在LB液体培养基中培养4h^12h时生长迅速,为对数生长期,在12h以后进入稳定期;采用活菌计数法绘制弗格森埃希菌对数生长期OD值与活菌数的函数关系,得到回归方程y=11.09x+0.157,R^2=0.9955,具有良好的相关性;确定了弗格森埃希菌对昆明小鼠的半数致死量LD50为2.944×10^7CFU,95%置信区间为1.557×10^7~4.817×10^7CFU。
弗格森埃希菌生物学特性及致病性研究弗格森埃希菌(Escherichiafergusonii)属肠杆菌科埃希菌属，是一种可以感染人与动物的条件性致病菌。弗格森埃希菌可引起牛羊沙门氏菌病，临床表现包括流产、腹泻和乳腺炎等。弗格森埃希菌的宿主较为广泛，有研究显示从牛与绵羊、腹泻鸵鸟、腹泻驯鹿、腹泻山羊和腹泻马中都分离出了弗格森埃希菌。此外，从患有腹泻、呼吸道疾病和败血症的猪和羊中分离出弗格森埃希菌。在澳大利亚调查1700余个脊椎动物宿主的研究中，弗格森埃希菌仅在634只鸟类中分离出4株分离物。该菌可引起腹泻，但其作用机制尚不清楚。本试验利用经测序鉴定为弗格森埃希菌的菌株进行培养，测定其生长曲线，确定该菌株的生长规律，同时利用处于对数生长期的弗格森埃希菌进行昆明小鼠的半数致死量LD₅₀的研究，确定该菌株对昆明小鼠的致死量。旨在为弗格森埃希菌的深入研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物与病原菌
4周龄昆明小鼠50只，雌雄各半，体重20g～25g，购自延边大学实验动物中心；弗格森埃希菌JL菌株由延边大学预防兽医学实验室分离鉴定及保存。
1.1.2主要试剂和仪器
胰蛋白胨、酵母淀粉、NaCl、琼脂粉、枸橼酸钠、柠檬酸、葡萄糖等均购自生物工程(大连)有限公司；菌体DNA全基因提取试剂盒购自OMEGA生物技术公司；PCR仪(T100)美国Bio-Rad公司产品；BioscreenC°PRO全自动微生物生长曲线分析仪（芬兰Astia公司产品）。
1.2方法
1.2.116SrDNAPCR扩增
按试剂盒说明书提取DNA，以DNA为模板进行PCR扩增。引物序列为27F5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和149R5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，由上海生工生物工程有限公司合成，预扩增片段长度为1500bp左右。PCR扩增体系(总体积为25μL)：去离子水17.3μL、10×Pfubuffer2.5μL、dNTP2μL、上、下游引物各1μL、Pfu酶0.2μL、模板1μL。将PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定目的的基因条带的菌株委托擎科生物有限公司进行测序。
1.2.2同源性分析
将测得序列与NCBI源序列进行比对，并进行同源性分析，DNAStar构建遗传进化树。
1.2.3弗格森埃希菌生长曲线的测定
将菌种按照0.1%的接种量接种于LB液体培养基中，充分混匀后分装至BioscreenC°PRO微生物生长曲线分析仪的专用微孔板中，每孔200μL，每组设置3个平行孔。将微孔板置于仪器中，设定培养温度为37℃，振荡频率为220r/min（连续中速振荡），选择波长600nm，每间隔2h自动测定一次吸光度（OD₆₀₀nm），持续监测18h。仪器自动记录各时间点的OD₆₀₀nm值，导出数据后计算每个时间点3个平行孔的平均值。以培养时间为横坐标、OD₆₀₀nm平均值为纵坐标，使用MicrosoftExcel2007绘制弗格森埃希菌生长曲线。
1.2.4弗格森埃希菌OD600nm值与菌液稀释倍数的关系
按照1.2.3所述方法将重悬的菌体进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍稀释，以无菌PBS为空白对照测定OD600nm值，使用稀释倍数为横坐标，OD600nm值为纵坐标，使用MicrosoftExcel2007绘制弗格森埃希菌OD600nm值与菌液稀释倍数的关系。
相关新闻推荐
2、水稻黄单胞菌噬菌体最佳MOI (A)、一步生长曲线、耐受性测定及基因组分析（三）
3、酵母frataxin缺陷模型揭示人铁蛋白L在衰老和细胞死亡中的保护作用（二）