研究简介
YycFG是参与生物膜形成调控的双组分系统之一，近年来作为抗菌和抗生物膜药物的潜在靶点受到越来越多的关注。尽管已开发出针对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的YycG抑制剂，但对粪肠球菌的研究仍较为有限。本研究以临床重要机会性致病菌粪肠球菌（Enterococcus faecalis）中"难以靶向又不可或缺"的双组分系统（TCS）组氨酸激酶 YycG（WalK/HK）为切入点，针对其胞内ATP结合/激酶结构域（HATPase_c）开展基于结构的药物发现，以期获得既能抑制浮游菌生长、又能干预生物膜形成的新型候选分子。
研究人员首先对粪肠球菌的 yycG 序列与功能域进行生物信息学与SMART注释，并以 E. coli渗透感受器 EnvZ 同源结构（PDB 1BXD）为模板，通过 I‑TASSER 构建 YycG HATPase_c 三维模型；将围绕ATP口袋半径约15 Å区域定义为对接位点，用 Glide/标准精度，高精度重打分（CSCORE）从 SPECS 小分子库中完成高通量虚拟筛选（HTVS），再依据分子多样性、形状互补、氢键与相互作用模式人工遴选，采购并实验验证79个候选分子。
本研究通过高通量虚拟筛选，筛选并鉴定出针对粪肠球菌中组氨酸激酶YycG的新候选分子。经自磷酸化试验和结合动力学分析验证，六种化合物（化合物-16、-30、-42、-46、-59和-62）对哺乳动物细胞具有较低的细胞毒性，可作为潜在的YycG抑制剂。其中，化合物-16能抑制粪肠球菌的悬浮培养细胞，包括万古霉素或利奈唑胺耐药菌株。相比之下，化合物-62对悬浮生长无影响，但在静态和动态条件下显著抑制了生物膜的形成。当与氨苄西林联合使用时，化合物-62可协同杀灭嵌入生物膜中的活菌。该研究表明，YycG抑制剂可能成为开发新型抗菌药物的重要策略。用于治疗难治性细菌感染的药物。
Bioscreen 全自动生长曲线分析仪的应用
使用Bioscreen C全自动微生物生长曲线监测系统对候选化合物的浮游抑菌活性进行了动态评估：首先将过夜培养的粪肠球菌OG1RF按1:200的比例接种至新鲜TSB培养基中，随后加入经二倍系列稀释的化合物（浓度范围200 μM至最低测试浓度），并设置含0.1% DMSO的空白对照组。将处理后的样品置于Bioscreen C生长曲线分析仪中，在37°C、220 rpm振荡及有氧条件下连续培养24 h，仪器每小时自动测定各孔在600 nm波长下的光密度（OD₆₀₀），无需人工取样即可生成连续的细菌生长动力学曲线。所有实验均设置三重平行重复以确保数据可靠性。该设备的核心作用在于将传统静态的MIC终点检测转化为动态的生长过程监测，通过对比不同化合物处理组的OD₆₀₀随时间变化的曲线特征（如生长延迟期延长、最大吸光度降低或曲线完全被抑制），直观反映化合物对浮游菌生长的抑制程度，既验证了compound-16等具有浮游抑菌活性的分子能显著压低生长曲线，也为compound-62等MIC>200 μM的分子"无浮游生长抑制作用但具备抗生物膜活性"的表型分工提供了关键动力学证据，与后续的MIC、time-killing及生物膜实验数据形成互补。
实验结果
本研究通过靶向粪肠球菌（Enterococcus faecalis）双组分系统组氨酸激酶YycG的HATPase_c结构域开展药物发现，经高通量虚拟筛选与多轮实验验证，最终确定6个小分子化合物（compound-16、-30、-42、-46、-59、-62）为潜在YycG抑制剂，其中compound-16可显著抑制浮游菌生长，对标准株OG1RF的MIC为25 μM，且对耐万古霉素/利奈唑胺的临床分离株仍保持活性，与氨苄西林、万古霉素或利奈唑胺联用能协同增强杀菌效果（24小时内降低>3 log₁₀ CFU）；而compound-62在高达200 μM浓度下不影响浮游生长，却能通过抑制初始黏附与胞外基质形成，在静态及动态流动条件下显著阻断生物膜发育，并对成熟生物膜具有清除作用，与8×MIC氨苄西林联用可使活菌杀灭率提升至72.71%；机制研究表明两化合物均通过结合YycG调控下游yycG/yycF及epbA、gelE等生物膜相关基因表达，且asRNA沉默yycG后化合物活性进一步增强，证实YycG为核心靶点；安全性评价显示所有候选分子对Vero细胞CC₅₀>200 μM且无显著溶血性，具备良好开发前景。
图1、粪肠球菌YycG组氨酸激酶的结构域分析。（a）YycG蛋白的保守结构域。蓝色矩形表示YycG的跨膜结构域；HAMP（组氨酸激酶、腺苷酸环化酶、甲基接受蛋白和磷酸酶）、信号输入与二聚化；PAS，信号感受器；PAC，位于PAS结构域C端的基序；HisKA，二聚化及组氨酸磷酸受体；HATPase_c，ATP酶，用于磷酸化过程的能量产生。（b）来自粪肠球菌OG1RF和大肠杆菌K-12的HATPase_c结构域氨基酸序列比对。
图2、YycG HATPase_c 模块的结构模型。使用 ITASSER 在线工具预测了 E. faecalis 中 YycG HATPase_c 模块的结构。（a）E. faecalis 中 YycG HATPase_c 模块的形状和表面特征。四个高度保守的基序 [N-盒（Asn501-Ala506）、G1-盒（Ser530-Ile538）、F-盒（Val546-Phe550）和 G2-盒（Gly563-Leu568）] 以不同颜色标注。（b）E. faecalis 中 YycG HATPase_c 模块的建模结构（浅粉色）与大肠杆菌中 EnvZ 的同源模块（绿色）的结构叠加图。（c）E. faecalis 中 YycG HATPase_c 模块 ATP 结合口袋的示意图。海洋色、紫色、青绿色和黄色分别代表口袋的 I、II、III 和 IV 区域。
图3、使用Octet RED96设备测定潜在YycG抑制剂与YycG′蛋白的结合亲和力。（a）通过Octet RED96仪器实时测量化合物16、-59、-62、H2-60和H2-81与YycG′蛋白的相互作用。红色、橙色、绿色、天蓝色和蓝色曲线分别代表在25 μM浓度下，化合物-59、H2-81、H2-60、-62和-16在结合与解离过程中的曲线；紫色曲线为空白对照。（b）化合物16（b）和化合物62（c）系列稀释液与YycG′蛋白相互作用的实时测量。从上至下的曲线分别表示100、50、25和12.5 μM浓度下化合物与YycG′蛋白的相互作用。化合物与蛋白的结合状态持续监测超过120秒，解离过程则持续观察超过200秒。
图4、对粪肠球菌（E. faecalis） planktonic 细胞的潜在抑制剂的生长曲线。将 E. faecalis ATCC 29121 和 OG1RF 的过夜培养物分别用 1:200 比例稀释至 1 mL TSB 中，取不同浓度的抑制剂（1.56–200 μM）进行梯度稀释后与培养基混合，随后向 100 孔板中加入 300 μL 培养液。将板置于 37 °C 下孵育，并使用德国 Bioscreen 分光光度计测定 OD600 值进行监测。数据独立重复三次获得，以平均值 ± 标准差（SDs）表示。图中显示了化合物-16 对 E. faecalis ATCC 29121 planktonic 细胞的生长曲线（a），以及化合物-16（b）、化合物-30（c）和化合物-62（d）对 E. faecalis OG1RF planktonic 细胞的生长曲线。
图5、化合物-16与氨苄西林、万古霉素或利奈唑胺联合对粪肠球菌OG1RF的抑菌曲线。细菌分别在37°C下以4×MIC浓度处理24小时，单独使用化合物-16或与氨苄西林、万古霉素或利奈唑胺联用。在0、1、3、5、7、11和24小时时取培养基分样（1 mL），依次稀释后，每种稀释液各取100 μL点涂至TSA平板上，并在37°C下孵育16–24小时。随后测定活菌数（CFU）。认为。每种化合物的活性通过各时间点的菌落形成数（log10 CFU/mL）来测定。使用0.1% DMSO处理的细菌作为对照。
总结
本研究通过靶向粪肠球菌双组分系统组氨酸激酶YycG的HATPase_c结构域开展药物发现，经高通量虚拟筛选与多轮实验验证，最终确定6个小分子化合物（compound-16、-30、-42、-46、-59、-62）为潜在YycG抑制剂，其中compound-16可显著抑制浮游菌生长，对标准株OG1RF的MIC为25 μM，且对耐万古霉素/利奈唑胺的临床分离株仍保持活性，与氨苄西林、万古霉素或利奈唑胺联用能协同增强杀菌效果（24小时内降低>3 log₁₀ CFU）。而compound-62在高达200 μM浓度下不影响浮游生长，却能通过抑制初始黏附与胞外基质形成，在静态及动态流动条件下显著阻断生物膜发育，并对成熟生物膜具有清除作用，与8×MIC氨苄西林联用可使活菌杀灭率提升至72.71%。机制研究表明两化合物均通过结合YycG调控下游yycG/yycF及epbA、gelE等生物膜相关基因表达，且asRNA沉默yycG后化合物活性进一步增强，证实YycG为核心靶点；安全性评价显示所有候选分子对Vero细胞CC₅₀>200 μM且无显著溶血性，具备良好开发前景。
该研究首次证实靶向粪肠球菌YycG可同时获得"抗浮游生长"与"抗生物膜"两类表型分子，其中compound-16与compound-62可作为传统抗生素的增效剂，为解决耐药粪肠球菌感染及医疗器械相关生物膜难题提供了全新策略。Bioscreen C MBR 全自动微生物生长曲线分析仪被用于胆汁耐受实验，仪器每小时自动测定各孔在600 nm波长下的光密度（OD600₀），无需人工取样即可生成连续的细菌生长动力学曲线；所有实验均设置三重平行重复以确保数据可靠性。
该设备的核心作用在于将传统静态的MIC终点检测转化为动态的生长过程监测——通过对比不同化合物处理组的OD600随时间变化的曲线特征，直观反映化合物对浮游菌生长的抑制程度，既验证了compound-16等具有浮游抑菌活性的分子能显著压低生长曲线，也为compound-62等MIC>200 μM的分子"无浮游生长抑制作用但具备抗生物膜活性"的表型分工提供了关键动力学证据。
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