摘要：【目的】筛选并分离出能裂解肠侵袭性大肠埃希菌噬菌体，分析其生物学特性，并探究其对污染猪肉的杀菌作用。【方法】采用双层平板法分离鉴定噬菌体，并测定其最佳感染复数，一步生长曲线等，对其基因组进行测序分析以及裂解功效的测定。【结果】从医院污水中分离鉴定能特异裂解肠侵袭性大肠埃希菌（Enteroinvasive Escherichia coli coli，EIEC）的噬菌体并命名为DK-13，其呈典型的蝌蚪状外形，包含一个正二十面体的头部和一个可收缩的螺旋对称的尾部，属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）噬菌体；生物学特性表明：最佳感染复数为0.01，潜伏期约为10 min，裂解期约为70 min，噬菌体DK-13能在50℃，pH 5.0-10.0条件下存活。全基因组测序表明，噬菌体基因组长约172 275 bp，GC含量为40.18%，预测其共有293个开放阅读框（open reading frames,ORF）,未发现已知耐药基因和毒力基因。应用试验表明：被污染的猪肉中表现的杀菌效果良好，宿主菌的数量明显减少。【结论】分离并鉴定一株新的烈性噬菌体DK-13，DK-13具有潜伏期短、裂解效率高等优势，在食品安全方面具有很大应用潜力。
大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）属于革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界中，绝大多数属于正常菌群，但其在具有某些特定毒力因子时具有致病性，能引起人和动物共同感染。且可通过污染被屠宰动物或其他动物源性食品等途径从食物链感染人体，可引起腹部绞痛，带血和黏液的腹泻等症状。抗生素一直是抗菌的重要手段之一，但由于抗生素的滥用，耐药菌株的大量出现，导致了未来没有针对耐药菌的药物可用的情况。因此迫切需要开发具有替代作用的新的抗菌策略。
噬菌体在自然界中种类繁多，具有高度多样化，基本感染现存的所有细菌。其基因组编码的蛋白质可用于食品安全防治、耐药菌株引起的感染治疗等。噬菌体还被发现在对养殖场饲养的牲畜的杀菌方面有较好的效果，从而限制病原体进入食物链的风险，还可用于检测动物源性食品中的病原体。例如，噬菌体产品SalmoFreshTM和EcoShiledTM已被开发并批准用于食品工业，以抑制食源性微生物。噬菌体裂解细菌的功效已经在各种研究中得到证实，使用噬菌体成为用于食品安全防治的有效方法。由于多数噬菌体裂解宿主菌的专一性，需筛选并分离新的噬菌体以扩增噬菌体库以增加宿主范围，为未来鸡尾酒噬菌体制剂应用提供数据参考。
本研究分离得到一株特异性较强的能裂解肠侵袭性大肠埃希菌的噬菌体，是一种潜伏期短、裂解效率高、耐高温以及耐酸碱的烈性噬菌体，具有应用于食品安全防治的潜力，为以后解决食品污染问题提供了一种新的解决策略。另外本研究还进行全基因组测序并分析预测了裂解宿主菌的相关基因，为进一步研究噬菌体应用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株和污水样品
宿主菌肠侵袭性大肠埃希菌D1从污染肉制品分离，由吉林大学基础医学院病原生物学系保存，经PCR鉴定为肠侵袭性大肠埃希菌，实验所用其他大肠埃希菌，蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌均由吉林大学基础医学院病原生物学系保存。
污水样品采集于吉林大学第一医院污水处理中心。
1.1.2培养基、主要试剂和仪器
营养琼脂（NA）、营养肉汤（NB）、改良克氏双糖铁培养基管，青岛高科园海博技术有限公司；聚乙二醇（PEG8000），Beijing Biotopped Science；DNaseI酶，RNaseA酶，大连TaKaRa公司；SM缓冲液，武汉卡诺斯科技有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris碱,北京康为世纪生物科技有限公司；无水乙醇、冰醋酸，天津市化学试剂有限公司；硫酸，锦州古城化学试剂有限公司；氢氧化钠，湖北鑫润德化工有限公司。
1.2方法
1.2.1宿主菌的分离与鉴定
吸取20μL EIEC冻干粉溶解液加入10 mL NB中，37℃，160 r/min培养5 h后，用无菌接种环蘸取菌液进行分区划线，过夜37℃培养，第2天观察形态，挑取单菌落加入NB中培养后保存。挑取EIEC单菌落进行PCR确认试验以鉴定。
1.2.2裂解性噬菌体的初步筛选
将未经处理的医院污水取出300 mL加入1.8 g固体CaCl2（0.6%）静置30 min，5 000 r/min离心10 min，取100 mL的污水上清液和100 mL NB，并与5 mL EIEC的新鲜菌液混合，37℃培养过夜。次日5 000 r/min离心3 min，经0.45μm滤器过滤后得到噬菌体初提液。取500μL EIEC菌液加入试管中，再加入5 mL半固体培养基（50℃左右），凝固后在表面中心处滴加2-3滴噬菌体初提液，晾干后倒置放入培养箱，37℃培养过夜。次日观察平板中心是否出现噬菌斑。
1.2.3噬菌体的分离纯化及测定滴度
挑出形态最好的噬菌斑加入宿主菌液中培养8 h，5 000 r/min离心3 min，所得上清液用0.45μm滤器过滤，得到噬菌体纯化液。取100μL噬菌体液倍比稀释液与100μL宿主菌液混合于试管中，再加入5 mL半固体培养基（50℃左右），混匀后倒在琼脂平板上，凝固后37℃倒置培养过夜。次日观察平板上的噬菌斑形态，挑取单个噬菌斑重复上述操作7-10次，最终得到纯化后的纯种噬菌体。
将纯化后的噬菌体液进行倍比稀释，重复一次纯化的步骤，37℃恒温培养过夜后，次日观察并记录各稀释梯度平板上噬菌斑的数量，依据公式算出噬菌体的滴度。
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