3.3. 筛选出的重金属对附着细菌之间ARG转移的影响
由于污水处理厂中的污泥细菌既处于浮游状态也处于附着状态，还通过微流控芯片进行了接合实验，使用0.5 mmol/L铅（II）、0.1 mmol/L砷（V）和0.005 mmol/L汞（II）分别研究它们对附着细菌群落中ARG转移的影响。如图3所示，微流控芯片上的细菌在48小时接合实验后形成菌落。接合事件通过显微图像中的绿色荧光细胞识别。
图3. 在不同金属胁迫下接合实验48小时后，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对活性污泥细菌ARG转移的芯片可视化。红色斑点为供体细胞，绿色斑点为接合子。（关于本图例中颜色参考的解释，读者请参阅本文的网络版本。）
尽管细菌受到重金属抑制，三种不同条件下的转移频率分别为4.29×10^-1、4.89×10^-1和6.22×10^-1（图4）。与无重金属实验（2.2×10^-1）相比，在这三种重金属的选定浓度下转移频率增加了约1.9–2.8倍。
图4. 金属胁迫条件下与参考条件（CK）相比的转移频率。转移频率基于每个条件45张图像的分析计算。
芯片上实验的T/D值也表明，与各自对照相比，在筛选出的重金属胁迫下转移频率增加，与上述浮游状态结果一致。且无重金属芯片上的转移频率与文献中附着状态细菌的报道值接近，如大肠杆菌MG1655的质粒pKJK5向活性污泥转移（5.11×10^-2–7×10^-1），大肠杆菌C600的质粒RP4向活性污泥转移（1.4×10^-2–1.9×10^-2）。
由于芯片上附着细菌之间的接触机会比孔板中多得多，微流控芯片培养中的转移频率比浮游细菌群落中的转移频率高一个数量级。此外，附着细菌可能对重金属更具抗性，例如，发现铜绿假单胞菌的生物膜形式与浮游形式相比，对铅离子的耐受性增加了2倍。芯片实验不仅证明了重金属（铅（II）、汞（II）和砷（V））对ARG转移具有促进作用，而且表明在附着状态下促进作用更强。
3.4. 接合子库的群落多样性和微生物代谢功能
从对照样品（无重金属）和每个接合实验样品（0.5 mmol/L铅（II）、0.1 mmol/L砷（V）和0.005 mmol/L汞（II））中，通过FACS分选至少20,000个接合子细胞，进行16S rRNA扩增子测序以分析其系统发育组成。
图5. Ck（无重金属对照样品）和不同重金属胁迫下接合子库中前25个属的接合潜力。热图数值代表log（PT），空值表示该属在接合子库中未被检测到。
图5是显示接合子库中前25个属log（PT）值的系统发育树。不同重金属条件下接合子OTUs的相对丰度不同。因此，根据公式（3）计算接合子中特定属的接合潜力（PT），以评估该属中细菌接收质粒的能力。
对照样品中优势属的PT值为假单胞菌（-0.005）、赫尔米尼单胞菌（-2.195）和不动杆菌（-2.872），与重金属条件不同。对于汞（II）和砷（V），接合子中假单胞菌的PT值分别为-0.014和-0.051，占96.75%和88.99%，意味着质粒转移的高潜力。此外，气单胞菌、肠杆菌和大肠杆菌-志贺氏菌属，在接合子库中分别占56.41%、32.00%和0.4%，具有较高的平均PT值，分别为-0.249、-0.495和-1.394，意味着在铅（II）胁迫下ARG转移的高潜力。特别是，上述六个属（赫尔米尼单胞菌、不动杆菌、假单胞菌、气单胞菌、肠杆菌和大肠杆菌-志贺氏菌）在活性污泥细菌中不占优势，但它们都具有接收质粒的高潜力。
根据接合子多样性，不同OTUs在三种不同金属胁迫下表现出显著增加的许可性，意味着特定属的接合潜力具有依赖性。例如，大肠杆菌-志贺氏菌在铅（II）中具有高PT值（-1.3937），约为其在汞（II）（-3.6677）和砷（V）（-3.5708）样品中值的三倍。
值得注意的是，随着重金属的添加，对照样品中转移潜力较低的一些属变得容易接受质粒，如气单胞菌和肠杆菌。此外，赫尔米尼单胞菌、不动杆菌、假单胞菌、气单胞菌、肠杆菌和大肠杆菌-志贺氏菌的PT值高于其他属，这突出了ARG传播到机会性病原体的可能性。上述六个属均属于变形菌门，可以稳定宿主IncP质粒并容易发展抗生素耐药性。此外，具有较高质粒许可性的假单胞菌、不动杆菌、气单胞菌和肠杆菌属于革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌的细胞壁较薄，含有较少的肽聚糖。质粒更容易转移到膜阻力较小的革兰氏阴性细菌，且IV型细菌菌毛通常生长在细胞上，这是ARG转移的主要通道。研究表明，活性污泥中易受质粒感染的细菌包括肠杆菌、不动杆菌和莫纳菌，上述大多数细菌属于这些类别。
因此，由于金属胁迫，ARG从肠杆菌宿主跨门转移到活性污泥群落的频率可能增加。这种增加可能在ARG传播中发挥重要作用。了解不同重金属对ARG转移的剂量-反应关系可以预测ARG传播的风险，也为污水处理过程中ARG的控制提供建议。
此外，由于PICRUSt是一种预测宏基因组基因功能内容的生物信息学工具，基于KEGG通路预测了对照样品和三种重金属（铅（II）、汞（II）和砷（V））暴露下接合细菌群落的潜在功能谱。在KEGG代谢通路水平的丰度组成中，植物相关细菌群落的16S功能基因类型主要包括环境信息处理（16.6–20.51%）、遗传信息处理（13.97–14.82%）、代谢（42.61–46.35%）、细胞过程（4.12–5.15%）等。对于金属处理样品，遗传信息处理、代谢和人类疾病的值高于对照样品。
图6. 不同重金属下细菌功能谱的变化（KEGG第3级）。Ck为无重金属样品。铅(II)、砷(V)和汞(II)的浓度分别为0.5 mmol/L、0.1 mmol/L和0.005 mmol/L。
如图6所示，四个样品中功能基因的分布显示出相似性。与对照样品和三种不同金属胁迫下，与环境信息处理相关的功能基因的相对丰度占主导地位，如转运蛋白、ABC转运蛋白、分泌系统和双组分系统，与氨基酸代谢（如精氨酸和脯氨酸）相关的代谢功能基因紧随其后。然而，在重金属条件下，转运蛋白、ABC转运蛋白和精氨酸与脯氨酸代谢显示出显著差异。
ABC转运蛋白与环境信息处理相关，在重金属胁迫下预测基因家族的相对丰度增加了1.61%。据报道，ABC转运蛋白可以运输重金属，是金属解毒所必需的。例如，大肠杆菌S17-1中ABC转运蛋白MacAB的异源表达表明MacAB对砷抗性至关重要，大肠杆菌AW3110中MacAB的表达表明MacAB负责砷的外排以维持细菌稳态。因此，推测接合子中丰富的ABC转运蛋白可能在接合过程中发挥类似作用。
此外，ABC转运蛋白参与抗生素耐药性。接合细菌群落中丰富的ABC转运蛋白可能在本研究中发挥类似作用。此外，氨基酸（如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）代谢是代谢簇中的主要通路，氧化磷酸化、氮代谢和原核生物中的碳固定通路归属于能量代谢，可能表明重金属的添加刺激微生物进行一系列代谢活动，如活性氧（ROS）响应系统和SOS响应通路，从而促进ARG转移。
4. 结论
在本研究中，评估了六种不同浓度重金属对污泥细菌群落中ARG转移的影响。开发了结合Bioscreen C和流式细胞术的高通量方法来进行接合实验和接合子计数。证明包括0.5 mmol/L铅（II）、0.1 mmol/L砷（V）和0.005 mmol/L汞（II）在内的重金属可以促进污泥细菌中的ARG转移。
与对照相比，转移频率增加了1.25至2倍。此外，应用微流控芯片培养附着细菌，证明了上述重金属对ARG转移的促进作用。假单胞菌、气单胞菌、肠杆菌和大肠杆菌-志贺氏菌是接合子的优势属，由于其高丰度和接收ARG编码质粒的潜力，应引起关注。接合子的功能预测表明，与重金属抗性相关的ABC转运蛋白最为丰富。本研究有助于估计和控制污水处理厂中的ARGs。
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