2 结果与分析
2.1 筛选物对不定芽分化的影响
2.1.1 筛选物卡那霉素对不定芽分化的影响
在试验的浓度范围内，筛选物卡那霉素(Km)对黄梁木不定芽分化有显著的抑制作用(表1)。Km浓度增大对分化率影响非常明显，当Km浓度由0增大到4 mg/L的时候，分化率由100%下降到95.00%，平均长芽个数由1.44个下降为1.25个；当Km浓度为8 mg/L，分化率已下降为52.6%，平均芽个数仅为1.0个，近一半外植体白化；当Km浓度15 mg/L时，分化率已下降为2.50%，平均芽个数仅为0.25个，白化率高达97.5%。当Km浓度为20 mg/L时，已完全抑制不定芽分化，愈伤组织的体积较小；当Km浓度大于50 mg/L时，愈伤组织形成已严重受抑制，外植体几乎不膨大(图1)。由此可见，在黄梁木遗传转化中，如采用卡那霉素作为筛选物，不定芽分化的筛选浓度可选择20 mg/L。
表1 卡那霉素对不定芽分化的影响
| Km浓度 Km concentration (mg·L-1) | 分化率 Differentiation rate/% | 长芽个数 Num. of buds | 白化率 An albino rate/% | 外植体状况 Statu of explants |
|---|---|---|---|---|
| 0(CK) | 100.00±0.00 | 1.44±0.18a | 0.00±0.00 | 绿色,疏松膨大 |
| 4 | 95.00±5.00b | 1.25±0.14b | 0.00±0.00 | 绿色,疏松膨大 |
| 6 | 61.52±5.01c | 1.25±0.32b | 0.00±0.00 | 绿色,疏松膨大 |
| 8 | 52.60±3.54d | 1.00±0.00 | 49.48±2.99d | 半数白化,愈伤稍小 |
| 10 | 37.17±2.53 | 0.88±0.25c | 62.83±8.54 | 近2/3白化,愈伤稍小 |
| 15 | 2.50±2.50 | 0.25±0.50d | 97.50±2.50b | 近全白化,愈伤膨大较小 |
| 20 | 0.00±0.00g | 0.00±0.00 | 100.00±0.00a | 白化,愈伤膨大较小 |
| 50 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 100.00±0.00a | 白化,无愈伤 |
注：表中数据为平均值±标准误，同列不同小写字母表示显著差异(P<0.05，n=3，Duncan法)；30 d统计。下同。
2.1.2 筛选物潮霉素对不定芽分化的影响
表2 不同浓度潮霉素对不定芽分化的影响
| Hm浓度 Hm concentration/(mg·L-1) | 分化率 Differentiation rate/% | 长芽个数 Num. of buds | 死亡率 Death rate/% | 外植体状况 Statu of explant |
|---|---|---|---|---|
| 0(CK) | 100.00±0.00a | 1.44±0.18a | 0.00±0.00d | 绿色,疏松膨大 |
| 2 | 75.00±2.50b | 1.15±0.27b | 0.00±0.00d | 绿色,疏松膨大 |
| 4 | 28.57±3.03c | 1.08±0.39 | 0.00±0.00d | 绿色,疏松膨大 |
| 6 | 21.43±2.72d | 1.00±0.26 | 40.00±1.54 | 淡绿色,疏松,愈伤较小 |
| 8 | 14.29±2.43c | 0.88±0.36d | 60.00±1.87b | 淡绿色,愈伤很小 |
| 10 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 100.00±0.00a | 无愈伤,少量外植体褐化 |
| 12 | 0.00±0.00f | 0.00±0.00 | 100.00±0.00a | 无愈伤,所有外植体褐化 |
从表2可看出，潮霉素对不定芽分化的抑制作用较强，不定芽的分化率随着潮霉素浓度的增大而减少。当潮霉素浓度为2 mg/L时，不定芽分化率即降低到75.00%，与对照组(CK)比较，分化率减少了1/4，同时，芽的伸长也略受抑制；当潮霉素浓度为4 mg/L时，不定芽分化率约为对照组的1/4，仅为28.57%；当潮霉素浓度为8 mg/L时，不定芽分化率仅为14.29%，而死亡率达60%，有70%的外植体褐化，芽伸长、叶伸展均严重受抑制；当潮霉素为8 mg/L时，愈伤呈淡绿色，体积很小，当浓度大于10 mg/L后，基本无愈伤组织生成，外植体不分化出芽(图2)，45 d后，所有外植体均褐化死亡。
2.1.3 筛选物头孢霉素对不定芽分化的影响
从表3可看出，头孢霉素对黄梁木不定芽的分化影响不大。在试验浓度范围内，所有外植体均无白化或褐化，依然呈疏松膨大状态，当头孢霉素浓度不超过200 mg/L时，分化率均为100%，平均长芽个数差异不大；当头孢霉素浓度为400 mg/L时，不定芽分化率依然高达91.12%，平均长芽个数为1.30个，外植体生长情况仍较好。
表3 头孢霉素对不定芽分化的影响
| Cef浓度 Cef concentrations/(mg·L-1) | 分化率 Differentiation rate/% | 长芽个数 Num. of buds | 外植体状况 Status of explant |
|---|---|---|---|
| 0(CK) | 100.00±0.00a | 1.44±0.18a | 绿色,疏松膨大 |
| 25 | 100.00±0.00a | 1.51±0.23a | 绿色,疏松膨大 |
| 50 | 100.00±0.00a | 1.50±0.42a | 绿色,疏松膨大 |
| 100 | 100.00±0.00a | 1.43±0.36a | 绿色,疏松膨大 |
| 150 | 100.00±0.00a | 1.52±0.49a | 绿色,疏松膨大 |
| 200 | 100.00±0.00a | 1.44±0.41a | 绿色,疏松膨大 |
| 300 | 95.00±3.62b | 1.29±0.58b | 绿色,疏松膨大 |
| 400 | 91.12±2.65c | 1.30±0.63b | 淡绿色,疏松膨大 |
2.2 筛选物对黄梁木无菌苗生根的影响
由图3可见，随着卡那霉素(Km)和潮霉素(Hm)浓度的增大，生根率和根长均迅速降低。
当卡那霉素浓度从4.0 mg/L增大到8.0 mg/L时，生根率从100%迅速降低为65.62%，根长也由2.6 cm降低为1.2 cm；当卡那霉素浓度等于或大于10 mg/L时，无菌苗无法诱导出不定根；另外，当卡那霉素浓度为50 mg/L时，嫩叶和芽出现了白化，芽的生长也受到抑制。
当潮霉素浓度从0到6 mg/L间变化时，无菌苗的生根率较高，均不低于85.00%的生根率；随着浓度增大到8 mg/L，生根率迅速降低至35.00%；而根长则对潮霉素浓度的增大变得较敏感，当潮霉素浓度为2 mg/L时，根长就降低为2.1 cm，比没有添加潮霉素的对照组减少了1.4 cm，当潮霉素浓度为8 mg/L时，根长迅速降至0.3 cm；当浓度为10 mg/L以上时，无菌苗已无法诱导出不定根。另外，当潮霉素浓度大于6 mg/L后，对芽、茎的伸长和叶片正常伸展均有较明显的抑制作用。
头孢霉素对无菌苗生根诱导的影响见图4。随着头孢霉素浓度的增大，生根率和根长缓慢下降。当头孢霉素浓度在0至150 mg/L的范围内，生根率均为100%，根长均为3.5 cm，并不受头孢霉素的影响；当浓度为200 mg/L时，生根率为98.6%，根长为3.2 cm，仅比对照组的生根率和根长分别减少1.4%、0.3 cm；当浓度为400 mg/L时，生根率和根长也只降低至95.52%和2.1 cm，无菌苗的茎、叶颜色仍呈绿色，无白化或褐化现象出现。表明头孢霉素对无菌苗诱导生根的影响较小。
2.3 头孢霉素对农杆菌抑制的效果
2.3.1 直接浸染外植体法
采用直接浸染外植体法的抑制结果见表4。在没有添加头孢霉素的培养基中，在接种次日，愈伤周围即出现菌斑，感染率达100%，随着头孢霉素浓度的增大，菌斑出现时间延长，感染率也逐渐下降，当浓度为50 mg/L时，7 d后才开始出现菌斑，感染率仅为10%。当头孢霉素浓度为100 mg/L或更高时，已没有菌斑出现，表明农杆菌生长已完全被抑制。
表4 不同头孢霉素浓度抑菌效果
| Cef浓度 Cef concentrations /(mg·L-1) | 接种数 Num. of explant | 菌斑出现时间 Day of plaque appear/d | 感染率 Infection rate/% |
|---|---|---|---|
| 0(CK) | 60 | 1 | 100 |
| 25 | 60 | 3 | 70 |
| 50 | 60 | 7 | 10 |
| 100 | 60 | - | 0 |
| 150 | 60 | - | 0 |
| 200 | 60 | - | 0 |
| 300 | 60 | - | 0 |
| 400 | 60 | - | 0 |
注：“-”表示没有菌斑出现。每处理30个材料，重复3次。
Note: ‘-’means no plaque is present. Each treatment including 30 materials, three repeats.
2.3.2 Bioscreen全自动生长曲线分析仪监测结果
采用Bioscreen全自动生长曲线分析仪监测抑菌效果见图5。随着头孢霉素浓度的增大，对农杆菌LBA4404的抑制效果越强。在不含头孢霉素的对照中，农杆菌生长迅速，OD600值在12 h内即达到平台期；当头孢霉素浓度为25 mg/L和50 mg/L时，农杆菌的生长明显受到延迟，但最终OD600值仍有上升。当头孢霉素浓度达到或超过100 mg/L时，在整个48小时的监测周期内，各孔的OD600值始终维持在接近接种初期的低水平，未见明显升高(图5)，表明头孢霉素浓度等于或大于100 mg/L时，已完全抑制农杆菌LBA4404的生长。
通过上述两种抑菌试验方法可看出，头孢霉素对农杆菌LBA4404有较好的抑制作用，当浓度为100 mg/L即可抑制农杆菌株的生长。
3 讨论与结论
3.1 讨论
通过农杆菌介导进行植物遗传转化，一般需建立高效再生体系和转化体系。在转化体系的建立中，要明确外植体对筛选物的敏感性，即筛选物在一定的浓度下可抑制非转化细胞的生长、发育和分化，而转化细胞因携带相应的抗性基因能正常生长、分裂和分化；同时，也要求该筛选物对外植体没有严重的毒性。不同物种、同一物种不同类型的相同外植体，以及同一物种的不同外植体，对筛选物的敏感性均不尽相同。例如，在紫雨桦离体叶片愈伤对不同筛选物的敏感试验中，头孢霉素和头孢曲松钠的筛选压范围为200~400 mg/L、特美汀的则为400~800 mg/L；在金发草愈伤的生长分化中，卡那霉素的筛选压为15 mg/L，但氨苄青霉素的浓度高达1000 mg/L时，对其愈伤的诱导分化仍影响不大；在刺槐形成层诱导愈伤分化的筛选物试验中，卡那霉素的筛选压浓度范围为100~125 mg/L，在无菌苗诱导生根的筛选浓度则为75 mg/L。本试验使用的3种筛选物，所得结果与上述3种植物的结果不尽相同。因此，在遗传转化中，筛选物类型和浓度的选择，需据植物不同植物、不同外植体和表达载体上携带的标记基因等因子经筛选而定。
卡那霉素能够与非转基因植物细胞内线粒体和叶绿体结合，而毒害植物绿色器官使其缺绿，导致白化或黄化死亡；而潮霉素通过竞争细胞叶绿体和线粒体中的核糖体与延长因子EF-2的结合位点，从而抑制肽链的延长，破坏细胞的翻译功能，使细胞中蛋白质合成受阻，使敏感组织褐化死亡。而转基因阳性植株会编码使对应抗生素失活的酶，从而产生抗性。本试验中，无论是不定芽分化还是生根诱导，外植体表现出对潮霉素更敏感，这与楸树、金发草和黄连木在遗传转化的抗生素试验结果相近；表明潮霉素较卡那霉素对黄梁木外植体的毒性更强，细胞发育和生长受到更强的抑制。另外，采用卡那霉素作为筛选物，生根过程的筛选压(10 mg/L)比不定芽分化过程的筛选压(20 mg/L)低，表现出植体在生根过程对卡那霉素更敏感，结果与刺槐遗传转化中筛选物试验的结果相同。
抑菌抗生素是农杆菌的有效抑制剂，在抑菌筛选物筛选中，不仅需要筛选物在适宜浓度下可抑制农杆菌的生长，而且在该浓度下，外植体的正常生长不受影响或影响较小。黄梁木外植体在不定芽分化和生根过程对头孢霉素的敏感性较低，当浓度高达400 mg/L时，影响仍较小；但农杆菌LBA4404较敏感，在头孢霉素浓度为100 mg/L时，即可抑制农杆菌的生长，较适合作为黄梁木遗传转化的抑菌剂。
3.2 结论
卡那霉素、潮霉素作为黄梁木遗传转化的筛选物，对黄梁木不定芽分化和生根有明显的抑制作用，且随着抗生素浓度的增大而增强。用卡那霉素和潮霉素作为黄梁木遗传转化不定芽分化、生根诱导过程的筛选物，卡那霉素的敏感浓度分别为20和10 mg/L，而潮霉素的敏感浓度均为10 mg/L；结合外植体在诱导不定芽分化、生根筛选试验中对头孢霉素敏感性，以及农杆菌对头孢霉素敏感性试验，可使用浓度为200 mg/L的头孢霉素抑制农杆菌生长或脱菌。该结果为黄梁木采用生物技术手段特别是利用农杆菌介导的遗传转化进行抗性育种奠定基础。