摘要
本研究评估了脱气、半胱氨酸添加和牛奶电还原处理对多种双歧杆菌菌株在巴氏杀菌奶中于+7°C冷藏储存4周期间存活率的影响。在脱气奶中的初步试验显示，八种受试菌株在冷藏储存期间对氧的敏感性存在显著差异。根据敏感性差异选择了三种菌株进行后续试验。试验还包括在37°C生长过程中氧的影响评估，结果表明观察到的生长抑制可作为氧对类似氧条件下双歧杆菌冷藏储存稳定性负面影响的指标。电还原处理对三种受试菌株中的两种在7°C储存4周期间的存活具有积极影响。半胱氨酸添加和单独脱气对储存期间细胞存活率的影响相似，表明电还原的益处主要与其降低样品中溶解氧水平的作用有关。本研究数据表明，牛奶的电化学还原以及脱气或还原剂添加均可用于提高双歧杆菌在7°C牛奶中延长储存期间的存活率。
1. 引言
促进健康和健康习惯是消费者的主要关注点。因此，含益生菌产品越来越受欢迎和认可。益生菌被定义为活的微生物，当以足量给予时，可对宿主产生有益的生理效应。最常见的是两个属的细菌获得了益生菌的认可，它们是乳杆菌属，特别是嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、约氏乳杆菌、加氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌；以及双歧杆菌属，特别是两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌。与食用益生菌产品相关的主要治疗和健康益处包括预防肠道感染、增强免疫系统、预防腹泻疾病、抗癌活性、预防高胆固醇血症、改善乳糖利用、预防胃肠道疾病和稳定肠道黏膜屏障。乳制品，如鲜奶、发酵乳、酸奶和奶酪，已被确定为益生菌微生物的良好载体食品，主要是因为它们的消费广泛，使其成为接触众多消费者的良好媒介。
有人建议每日摄入量应在10⁸至10⁹菌落形成单位（cfu）之间，但一些作者推荐更高的数量。然而，对几种市售产品进行的调查显示，消费时的活菌数量较低。多种因素可能导致储存期间的存活率损失，而氧敏感性被认为是益生菌产品生产和储存中的一个重要问题。已研究了多种保护细菌免受氧毒性有害影响的策略，如使用特殊的高耗氧菌株、在酸奶中使用抗坏血酸作为除氧剂、微胶囊化、使用对氧渗透性较低的包装材料以及氧化应激适应。半胱氨酸是一种强还原剂，已知可降低溶液的氧化还原电位。尽管将半胱氨酸添加到含益生菌产品中可能会影响其风味，但将其添加到生长培养基或发酵乳制品中已证明低氧化还原电位值有利于双歧杆菌储存期间的存活。然而，尚不清楚将半胱氨酸添加到未发酵奶中是否同样有益。
电解是一种利用电能迫使反应在与待处理液体接触的电极表面发生的过程。在使用的双室系统中，与阴极接触的流体发生还原反应（电还原）。该过程在食品工业中已有一些应用，但从未用于影响牛奶中的微生物稳定性，或用于增强双歧杆菌的稳定性。
本研究的目的是验证通过电还原处理将牛奶的氧化还原电位降低至负值是否能有效提高三种双歧杆菌菌株在冷藏储存4周期间的存活率。还比较了所选双歧杆菌菌株在电还原奶、脱气奶、添加半胱氨酸奶和对照奶中的存活情况。
2. 材料与方法
2.1 微生物和培养条件
本研究使用了代表双歧杆菌五个物种的八种不同菌株：两歧双歧杆菌KYO、长双歧杆菌Rosell-R023、长双歧杆菌411 BBL、短双歧杆菌ATCC 15700、两歧双歧杆菌ATCC 29521、婴儿双歧杆菌ATCC 15697、长双歧杆菌ATCC 15708、动物双歧杆菌乳亚种DSM 10140。所有菌株均来自食品研究开发中心的双歧杆菌保藏库。冻干培养物在1 mL灭菌复水培养基（1.5%蛋白胨、1.0%胰蛋白胨和0.5%肉提取物）中复水，随后以10%（v/v）接种到MRS肉汤中，并在厌氧室（85% N₂、5% CO₂和10% H₂）中于37°C培养24小时。在相同培养条件下进行一次1%（v/v）接种的继代培养。储备培养物通过将新鲜继代培养物与20%甘油和灭菌20%（w/v）复原脱脂乳按2:5:5比例混合制备，随后分装为1 mL置于2 mL小瓶中，于-80°C保存。
2.2 基于氧敏感性的菌株筛选
由于设备限制，无法对所有八种菌株进行牛奶电还原效果评估。因此，进行了筛选程序以选择对牛奶储存期间氧敏感性不同的培养物。在每次独立试验前，通过向99 mL MRS肉汤中添加一支解冻的储备培养物并在厌氧室中于37°C培养16至24小时来制备新鲜培养物。培养时间可变，以便每种培养物在达到生长稳定期初期时收集。在当地超市购买微滤巴氏杀菌奶（脂肪含量2%，2 L），转移至两个1 L灭菌瓶中。其中一个样品通过通入氮气进行脱气，直至氧浓度低于0.1 g/L。该操作在层流通风橱中进行以尽量减少牛奶污染。脱气后立即用无菌铝箔覆盖 bulk 样品，并立即转移至厌氧室进行后续操作，以尽量减少氧的重新进入。未脱气的1 L样品保存在无菌层流通风橱中。两个1 L bulk 样品分装为100 mL转移至100 mL灭菌玻璃瓶中，置于冰水浴中直至牛奶温度达到4°C。随后用新鲜培养物接种牛奶样品，浓度约为10⁷ cfu/mL。每种牛奶（脱气和未脱气）各保留两瓶未接种的作为对照用于后续测量。
未脱气奶在需氧条件下于7°C培养2周，脱气奶在相同温度下置于厌氧罐（3 L，含三个Anaerogen产气袋）中储存。共进行了六次独立试验。
2.3 细胞生长研究
使用Thermo Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪通过读取光密度（OD）获得八种菌株的生长曲线，以研究菌株在不同条件下的生长行为：（a）在常规MRS培养基中；（b）在添加半胱氨酸-HCl（0.5%）的MRS中以研究还原培养基中的生长；（c）在添加抗坏血酸（1%）的MRS中以研究低氧水平培养基中的生长。对于该实验的三次独立试验中的每一次，通过向每孔添加50 µL石蜡油制备额外平板，以在厌氧条件下研究相同培养基。每块平板上，每种培养基填充两孔（200 µL）以获得每种菌株的重复读数，并用20 µL通过在适当培养基中向9 mL添加1 mL冻存小瓶制备的新鲜培养物接种。平板于37°C培养24小时。每15分钟进行一次OD测量（600 nm），Bioscreen C单元板振荡设置为每次OD读数前"中度振荡"30秒。
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