工业菌株的杂交是用于改善和组合各种工业相关性状的最有效和简单的技术之一。在经典育种策略中，相反交配型的单倍体菌株杂交产生新的二倍体后代。然而，这种方法不能直接应用于工业菌株，因为大多数工业菌株是二倍体、多倍体或非整倍体。因此，需要鉴定具有与亲本工业菌株原则上相同优良性状特征的单倍体减数分裂分离株，当涉及仅在工业规模上重要的性状时，这变得极其困难。因此，用于育种的单倍体后代永远不会表现出与原始二倍体菌株完全相同的积极性状组合。这使得工业酵母菌株的育种成为一个巨大的挑战。在我们的工作中，我们使用了原始二倍体MATα/α菌株GS1.11-26进行交配，而不是单倍体衍生物，以保持该菌株优良D-木糖发酵能力的完整遗传基础。
通过两个交配能力二倍体亲本的杂交构建杂交菌株此前已有描述。然而，在那篇报道中，没有对四倍体杂交菌株应用进一步的减数分裂重组步骤来分离二倍体分离株，这可能有两个原因。首先，酿酒酵母中最稳定的基因组大小似乎是二倍体状态。这表明在最佳和胁迫环境中，四倍体到二倍体的倍性自发进化频繁发生。这意味着四倍体工业菌株可能显示出较低的稳定性，并且在其工业使用过程中在转变为较低倍性时可能很容易丢失染色体而失去重要性状。其次，减数分裂重组可以在细胞群体中产生巨大的多样性，因此四倍体的孢子形成可以产生比四倍体亲本菌株性能更优的菌株。这在我们的工作中也得到了观察，其中获得了比四倍体亲本具有更高D-木糖利用速率的二倍体分离株。这可能是由于维持高效D-木糖利用的隐性等位基因的参与。
我们使用了两种方法来改进GS1.11-26菌株。与Ethanol Red分离株的回交主要旨在消除在开发高木糖发酵能力和抑制剂耐受性过程中引入该菌株背景中的负面性状，因为我们在育种过程中保持了原始Ethanol Red背景。这种方法此前已被描述为有益于清除突变菌株中的有害突变。另一方面，与Fseg25菌株的育种引入了新的工业遗传背景，主要旨在进一步增强抑制剂耐受性，但存在丢失生物乙醇生产菌株重要性状的风险。两种方法都成功产生了显著改进的菌株。GSE16菌株不仅失去了其亲本GS1.11-26的低葡萄糖利用和有氧生长速率，而且显示出至少与原始未进化亲本菌株HDY.GUF5一样高的抑制剂耐受性。GSF335和GSF767菌株也很大程度上失去了其GS1.11-26亲本的负面特性，而且还获得了Fseg25亲本至少部分非常高的抑制剂耐受性。
三个杂交菌株被评估了各种工业相关性状，包括对不同抑制剂的耐受性、D-木糖/葡萄糖混合物中的发酵性能以及超高浓度发酵中的性能。与GS1.11-26相比，所有三个新杂交菌株在各种胁迫条件下表现出好得多的总体性能。没有一个菌株在所有条件下都脱颖而出。相对性能随测试而变化。在云杉水解物的半厌氧批次发酵中，三个菌株与GS1.11-26相比表现出短得多的迟滞期。另一方面，GS1.11-26非常高的D-木糖发酵能力在新杂交菌株中没有完全保持。尽管三个杂交菌株能够在32小时内消耗所有37克/升D-木糖和36克/升葡萄糖，但它们仅保留了GS1.11-26最大D-木糖利用速率的35%至60%。三个新杂交菌株更高的抑制剂耐受性可以解释为什么它们在云杉水解物中显示出与GS1.11-26菌株相当的D-木糖利用速率。葡萄糖利用速率也显著高于GS1.11-26，这可能也是由于它们对云杉水解物中抑制剂的更高耐受性。对多种胁迫因素的耐受性此前已被证明与酿酒酵母中的高乙醇产量和高乙醇生产速率相关。此外，与葡萄糖发酵相比，D-木糖发酵对胁迫因素更敏感，特别是对乙酸。GS1.11-26对乙酸（可能还有其他抑制剂）耐受性的严重降低可以解释其在云杉水解物中比在合成培养基中D-木糖利用速率较低的原因。另一方面，与合成培养基相比，三个新杂交菌株在云杉水解物中D-木糖利用速率的降低不如GS1.11-26严重，这可以用它们更高的抑制剂耐受性来解释。
已分离出其他D-木糖发酵能力高于三个选定菌株的二倍体杂交分离株，但它们在葡萄糖中显示出非常慢的生长速率，并且抑制剂耐受性也降低。因此，由于这些负面特性而被排除。难以保持亲本菌株GS1.11-26优良的D-木糖发酵速率可能表明，GS1.11-26菌株中的一个或多个负面背景突变可能与高D-木糖发酵速率有因果关系或结构联系。如果这些性状有因果联系，对高效D-木糖发酵重要的有益基因或位点可能与降低的生长速率或更高的抑制剂耐受性有关。这将意味着在该菌株背景中不可能或很难将高一般稳健性和高D-木糖利用能力结合起来。然而，如果负面突变仅与阳性遗传修饰结构相关，即彼此在基因组中靠近，它们可以在不影响优良D-木糖发酵性能的情况下被去除。因此，进一步的研究应侧重于鉴定高效D-木糖发酵以及高抑制剂耐受性的遗传基础，以便通过逆向代谢工程进行工程化。
生物乙醇生产通常在超高浓度发酵中进行，使用高浓度底物以达到最大最终乙醇浓度。这些底物包括第一代原料，如甘蔗糖蜜、淀粉或谷物，以及未来的第二代原料，特别是木质纤维素废物流和生物能源作物。高最终乙醇浓度具有多重优势。它降低了乙醇蒸馏成本，还降低了工厂中的液体体积，从而在加热、冷却、泵送和运输成本方面节省大量费用。超高浓度发酵造成高胁迫，特别是发酵开始时的渗透胁迫和发酵结束时的乙醇胁迫。这导致更长的发酵时间和由于更高残留糖而降低的乙醇产量。因此，新酵母菌株在超高浓度发酵中的性能是其在实际工业实践中使用的关键质量标准。这一点尤其重要，因为亲本菌株GS1.11-26在超高浓度发酵中的最大乙醇积累能力受到严重损害。因此，我们还评估了三个新杂交菌株在超高浓度发酵中的性能，发现它们不仅比GS1.11-26好得多，而且在某些情况下甚至比原始HDY.GUF5菌株表现出改善的性能。杂交菌株GSF335与其四倍体亲本以及两个二倍体亲本菌株GS1.11-26和Fseg25相比表现出显著增强的性能。这清楚地表明，与二倍体菌株的减数分裂重组能够进一步改善重要性能性状，这些性状在目前使用的最佳生物乙醇生产菌株中已被认为非常高。
结论
我们成功开发了三种强健的工业酵母菌株，将高效的D-木糖利用与高抑制剂耐受性相结合，用于木质纤维素水解物的生物乙醇生产。两个菌株（GSF335和GSF767）是通过高效D-木糖利用菌株GS1.11-26（源自Ethanol Red）与从580多个酵母菌株筛选中获得的最具抑制剂耐受性菌株的减数分裂重组获得的。菌株GSE16具有纯Ethanol Red背景，通过GS1.11-26与Ethanol Red单倍体衍生物的回交开发。所有三个菌株在有氧生长速率、葡萄糖消耗速率和抑制剂耐受性方面与GS1.11-26相比表现出优异的性能。三个菌株在复合培养基中的D-木糖利用速率与GS1.11-26相比有所降低，但在富含抑制剂的酸预处理云杉水解物中是可比的。由于高稳健性、背景菌株Ethanol Red在工业应用中的良好记录以及高效的D-木糖利用能力，三个菌株在工业生物乙醇生产中具有很强的直接应用潜力。本研究表明，通过与二倍体菌株直接进行减数分裂重组，并通过筛选大量菌株或分离株的多步选择过程，使用简单的高通量筛选淘汰差表现者，到更接近工业条件的详细评估条件选择最佳表现者，可以获得具有工业重要性状最佳特征的菌株。
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