3. 结果
3.1 BS3对微生物群落组成的影响
在本研究中，用不同浓度的BS3处理后，进行平板计数以量化孵育10天和90天后土壤中可培养细菌的变化。细菌群落的生态生理结构变化由EP和CD指数指示。通过PCR扩增高度保守的16S rRNA基因并用DGGE分析，监测BS3对细菌群落多样性的影响。
如表1所示，孵育10天后，新鲜土壤中的可培养细菌计数约为每克土壤7 log CFU。如预期，灭菌土壤中未检测到可培养细菌。与未添加BS3的土壤相比，所有添加BS3的土壤中的可培养异养细菌CFU计数均显著降低。BS3处理强度的增加导致CFU计数逐渐降低，从0.05% BS3处理的约6 log CFU/克土壤到0.50% BS3处理的4 log CFU/克土壤。0.05% BS3处理中的细菌计数与0.50% BS3处理显著不同。与新鲜土壤相比，0.50% BS3处理中的细菌计数下降了约3 log CFU/克土壤。BS3处理土壤中的EP指数下降，但除0.50% BS3处理外，无统计学显著变化。相反，除0.05% BS3处理外，BS3处理土壤中的CD指数显著增加。
孵育90天后，0.05%、0.15%和0.30% BS3处理中的CFU计数大幅增加（表1），可能是因为适应了BS3存在的细菌生长。然而，除0.05% BS3处理外，BS3处理土壤中的CFU计数仍显著低于新鲜土壤，0.50% BS3处理中CFU降低高达3 log。与第10天相比，第90天0.50% BS3处理中的可培养细菌CFU计数无显著变化，表明该BS3水平对大多数革兰氏阴性细菌的恢复过高。第90天0.15%和0.30% BS3处理中的CFU计数彼此无显著差异。BS3处理土壤中的细菌群落EP指数下降。与10天孵育后观察到的不同，0.30%和0.50% BS3土壤中的EP值显著低于新鲜土壤，而第90天所有处理之间的CD值无显著差异。
图2。经不同浓度BS3培养10天（上图）和90天（下图）后，具有改良微生物群落的土壤中细菌 DGGE 模式的聚类分析。
与生理结构相反，基于细菌群落DGGE图谱的多样性指数仅在第10天反映细菌多样性的轻微变化（表2）。除0.50% BS3处理外，与新鲜土壤相比，添加BS3的土壤中的Shannon多样性指数和丰富度无显著变化。与其他处理相比，0.3%和0.5% BS3土壤中的均匀度显著降低。细菌群落DGGE图谱的聚类分析显示，所有处理相似，在大约70%相似性水平上聚在一起（如图2a所示）。值得注意的是，0.50% BS3处理的三个重复中的两个在大约80%相似性上明显聚在一起。未观察到其他明显的分离模式。
相反，孵育90天后，BS3显著改变了土壤细菌群落结构（表2）。与新鲜土壤相比，BS3处理土壤中的多样性指数H'、E和S显著降低，三个指数均随BS3强度的增加而下降。值得注意的是，孵育90天后，与新鲜土壤相比，0.50% BS3处理失去了57%的DGGE可检测物种。DGGE图谱的聚类分析显示，处理土壤中的细菌群落结构与新鲜土壤中的明显不同。观察到非常明显的剂量依赖效应，有两个明显的模式（如图2b所示）：新鲜土壤在大约60%相似性水平上聚在一起。0.50% BS3处理在45%相似性上分开聚类，而0.05%、0.15%和0.30% BS3土壤（各有一个重复例外）在各种相似性水平上分开聚类。
3.2 大肠杆菌菌株在土壤中的动态
虽然未检测到大肠杆菌的明显生长，但所有三种大肠杆菌菌株都能在土壤中持续存在较长时间，有些甚至在孵育结束时（150天）仍可检测到（如图3所示）。随时间变化的大肠杆菌变化被用于检查接种菌株在土壤微宇宙中的动态。这种方法常用于农业田间的大多数监测实践。一般而言，所有三种大肠杆菌菌株的存活模式与一级动力学模型非常吻合，该模型是描述土壤中肠道细菌死亡的最常用模型，R²值范围为0.821至0.937。大肠杆菌数量随时间逐渐下降，衰减速率范围为每天每克土壤0.04至0.12 log CFU（如图3所示）。
图3. 三种大肠杆菌菌株在不同浓度BS3处理土壤中的存活模式，新鲜土壤与无菌土壤分别作为阳性对照和阴性对照
土壤中大肠杆菌的死亡模式具有菌株依赖性：狗大肠杆菌菌株在土壤中比其他两种菌株衰变更快：在孵育的前75天，狗菌株的水平下降高达8个数量级，而另外两种仅下降2至6个数量级；狗菌株在孵育120天后无法从所有处理中检测到，而另外两种菌株表现出更强的持久性，在某些微宇宙中甚至在150天孵育后仍可检测到。
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