2.6 PCR-DGGE分析
使用Mobio PowerSoil DNA分离试剂盒从土壤中提取DNA。进行了修改以提高提取效率和产量。通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA的产量和片段化，然后进行GelStar染色和紫外光下观察。DNA提取物储存在-20°C以备将来使用。
进行聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）分析以研究土壤微生物群落结构。使用通用细菌引物对341FGC/907R，从土壤DNA提取中扩增16S rRNA的V3区域的566 bp片段，在Eppendorf Mastercycler中进行。使用1微升DNA提取物作为模板，在25微升反应体积中，含有1 U Taq DNA聚合酶和1×PCR缓冲液，含0.3 mg/ml BSA。PCR方案包括95°C变性3分钟，然后进行27个循环：94°C 30秒，64°C扩增30秒，72°C延伸30秒，最后72°C延伸30分钟。通过标准1%琼脂糖-0.5×Tris-硼酸-EDTA凝胶电泳与GelStar染色检查扩增产物的大小和产量。
将20微升PCR产物在SE 600 Ruby标准双冷却垂直单元中进行DGGE。含有8%聚丙烯酰胺和40-60%变性剂梯度的0.75毫米厚凝胶，在1×TAE缓冲液中80 V和60°C下电泳16小时30分钟。凝胶用GelStar核酸染色剂染色，使用Gel Doc XR成像系统捕获凝胶图像。
从DGGE凝胶上切下感兴趣的条带，在4°C下100毫升水中储存过夜，以使DNA被动扩散出凝胶条带，然后进行再扩增。使用引物对341FGC/907R，将10微升洗脱的DNA作为模板，如上所述进行扩增，并将产物进行DGGE以检查其迁移。确认的DNA片段使用引物对341F/907R再扩增，使用Qiaquick凝胶提取试剂盒从1%琼脂糖凝胶中纯化，并克隆到pCR2.1-TOPO载体中。使用TOPO TA克隆试剂盒按照制造商说明，将连接产物化学转化到大肠杆菌中。对插入片段进行测序，使用BLASTN与NCBI数据库进行比较。使用UltraClean微生物DNA分离试剂盒从三种菌株的纯培养物中分离DNA。使用上述方法扩增和测序16S rRNA V3区域的566 bp片段。
2.7 数据分析
将大肠杆菌通过转换为log CFU·g⁻¹进行标准化。根据方程 Mₜ/M = M₀e⁻ᵏᵗ计算土壤中大肠杆菌的存活率，其中Mₜ是时间t时的细菌数量，M₀是初始细菌数量，k是细菌净存活率的一级速率系数（每天），t是时间（天）。
使用GelCompar II分析所有样品的DGGE图谱，程序归一化后手动调整。凝胶中存在的每个条带位置在其在泳道中的存在或缺失进行二进制编码，每个泳道使用相似性矩阵显示为树状图进行比较。用于计算树状图的聚类算法是未加权配对组法与数学平均。凝胶图像也转换为密度分布图，确定物种（条带数量）及其推断的丰度。物种丰富度指在给定土壤样品中检测到的条带数量。物种均匀度作为给定土壤样品中DGGE条带分布均匀程度的度量，计算为 E = H'/ln(S)。为比较所有处理微生物群落的变化，从方程 H' = -Σpᵢlogpᵢ 计算Shannon-Weaver指数，其中pᵢ = nᵢ/N，nᵢ是第i个DGGE条带的条带强度，N是每个泳道中所有条带强度的总和。
| 处理 | 10天孵育a | 90天孵育 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| H' | E | S | H' | E | S | |
| 新鲜土壤 | 2.94±0.11a | 0.95±0.02a | 22±2.1a | 3.05±0.05a | 0.97±0.02a | 23±1.0a |
| 0.05% BS3 | 2.81±0.06a | 0.92±0.01b | 21±2.5a | 2.55±0.12b | 0.86±0.01b | 19±2.1b |
| 0.15% BS3 | 2.80±0.08a | 0.95±0.01a | 19±1.9a | 2.48±0.10b | 0.87±0.02b | 17±1.3b |
| 0.30% BS3 | 2.83±0.05a | 0.96±0.01a | 19±1.0a | 2.30±0.09b | 0.82±0.01b | 16±1.6b |
| 0.50% BS3 | 2.31±0.10b | 0.92±0.02b | 12±1.4b | 1.94±0.11c | 0.84±0.01b | 10±1.3c |
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