2.3 大肠杆菌接种物制备与孵育
使用最初分离自牧场土壤、人粪便和狗粪便的菌株作为接种物。简要地，将10克新鲜粪便或土壤样品用95毫升磷酸盐缓冲液稀释，280 rpm振荡30分钟。对于粪便样品，将200微升上层无固体物质相的10⁻⁵稀释液涂布于mFC琼脂；对于土壤样品，使用200微升未稀释的无土悬浮液。平板在35°C下孵育2小时，然后在44.5°C下孵育22小时。将蓝色菌落划线接种于mFC琼脂，44.5°C孵育24小时。将mFC琼脂上的单菌落接种于MacConkey琼脂平板，37°C孵育24小时。MacConkey琼脂上的粉红或红色菌落通过一系列生化试验确认为大肠杆菌：在最低乳糖琼脂平板上生长、在最低柠檬酸盐琼脂平板上不生长和吲哚产生。确认的菌株还使用API 20E试纸条进行测试。本研究使用的三种菌株被API 20E鉴定为大肠杆菌，鉴定评分优秀。使用Bioscreen C自动微生物生长曲线分析系统构建三种菌株的生长曲线以比较其生长动力学。观察到非常相似的生长速率和动力学值，表明三种菌株具有可比性。
将营养肉汤中过夜培养的大肠杆菌在3000×g和4°C下离心30分钟收获，将沉淀细胞重悬于无菌水中，在3000×g和4°C下离心30分钟洗涤两次，然后重悬于无菌水中以达到9 Log CFU/ml的最终浓度。然后将培养物在20°C下保持4小时，以确保任何过量营养物质被细菌利用。
通过喷雾和轻轻混合将大肠杆菌接种到土壤微宇宙中，建立约8 Log CFU/克干土的细胞密度。使用如此高浓度的接种物是为了确保后续DGGE分析能够检测到大肠杆菌。最终接种密度通过连续稀释和菌落计数确定。微宇宙在25°C黑暗条件下孵育总计150天。在0天（接种后1小时）、7、14、21、28、45、60、75、90、120、150天对微宇宙土壤进行破坏性采样和可培养大肠杆菌计数。在0、21、45、75、90、120和150天使用DGGE分析土壤样品的微生物群落变化。孵育期间的水分损失通过添加去离子水进行补偿，以保持恒定的土壤水分状态。
2.4 细菌CFU计数和细菌指数计算
将土壤样品（5克）装入45毫升无菌磷酸盐缓冲稀释水中，使用超声波破碎仪在冰上超声30秒。将无颗粒上清液用无菌PBW进行十进制稀释。将200微升适当稀释液的等分试样双份涂布于R2A培养基，室温（25°C）下孵育最长10天。每天对平板上的菌落计数前6天，之后每两天计数一次，共4天。选择具有30-100个菌落的平板进行计数。
为表征细菌群落组成，计算了两个指数。按照Sarathchandra等提出的方法计算菌落发育指数：CD = (N₁/1 + N₂/2 + N₃/3 + N₄/4 + N₅/5 + N₆/6 + N₈/8 + N₁₀/10) × 100，其中N代表第1、2、3...10天出现的细菌菌落比例。通常假设高CD值表明r-策略者比例更大，而低值则表明K-策略者比例更高。按此处计算，CD值范围为100（如果所有菌落在第1天出现）到10（如果所有菌落在第10天出现）。
生态生理指数如De Leij等所述，改编自Shannon多样性指数的概念，通常用于量化琼脂上的细菌菌落发育。EP指数计算为：EP = -Σ(Pᵢ × log₁₀Pᵢ)，Pᵢ是第i类的种群/总种群，共八个类别（每天出现的菌落）。较高的CD和EP指数表明菌落类别分布更均匀。
2.5 孵育土壤中的大肠杆菌计数
在每个时间点从每个处理收集三个小瓶进行破坏性采样和可培养大肠杆菌计数。将5克（鲜重）土壤加入含有45毫升无菌PBW的50毫升锥形离心管中，使用超声波破碎仪在冰上超声（设置6）30秒。静置10分钟后，将无颗粒上清液进行十进制稀释，并按照标准膜过滤方案通过膜过滤系统过滤。简要地，将溶液通过0.45毫米膜过滤器过滤，在改良膜耐热大肠杆菌琼脂上35°C孵育2小时，然后在44.5°C下孵育18-22小时。红色或洋红色菌落被计为大肠杆菌。当可培养大肠杆菌数量下降到膜过滤法的检测限（3 log CFU）以下时，采用每稀释度五管的MPN方法进行计数。
表1 不同水平胆盐（BS3）处理土壤中的总可培养异养细菌（菌落形成单位，CFU）、生态生理指数（EP）和菌落发育指数（CD）。CFU从25°C下孵育48小时的R2A培养基中计数。CD按照Sarathchandra等计算，EP指数如De Leij等所述。
| 处理a | 10天孵育b | 90天孵育 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| CFU计数 | EP | CD | CFU计数 | EP | CD | |
| 无添加 | 6.95±0.02a | 0.72±0.02a | 25.1±3.5a | 7.11±0.11a | 0.66±0.03a | 22.3±2.7a |
| 0.05% BS | 5.91±0.31b | 0.70±0.01a | 26.4±2.8a | 6.63±0.05a | 0.60±0.01a | 24.5±2.5a |
| 0.15% BS | 5.07±0.22b | 0.64±0.01a | 30.7±2.9b | 5.93±0.06b | 0.58±0.02a | 22.1±1.5a |
| 0.30% BS | 4.38±0.52b,c | 0.62±0.01a | 33.8±4.2b | 5.26±0.13b | 0.55±0.02b | 25.3±3.1a |
| 0.50% BS | 4.02±0.33c | 0.51±0.02b | 37.3±4.1c | 3.92±0.24c | 0.42±0.01c | 25.1±2.2a |
| 灭菌（S） | 0 | N/Ac | N/A | 0 | N/A | N/A |
ᵃ BS = 胆盐
ᵇ 平均值±标准误，同列不同字母表示P < 0.05的显著差异
ᶜ N/A = 不适用
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