3.4. 噬菌体调控元件的验证
先前对调控元件的计算搜索预测了许多推定的φR1-37启动子,其特征是富含A-dU的共有序列。RNA测序实验证实了56个预测的、保守的启动子,并在很大程度上支持先前发表的共有序列。在推定的新转录起始位点的上游区域未观察到新的保守序列。Skurnik等人(2012年)也预测了16个推定的sigma-70启动子。然而,RNA-seq数据分析显示,这些主要是弱和中强启动子,位于编码病毒粒子结构蛋白的基因上游。从这些启动子开始的转录在感染过程中是稳定的,并导致低到中等丰度转录本的产生。除了基本启动子元件的差异之外,由其他因素导致的独特表达模式可以解释在序列水平上早期和晚期启动子之间缺乏区分的原因。这些启动子可能受到转录因子出现、RNAP修饰或内在启动子强度差异的调控。
3.5. φR1-37基因组中的新型RNA种类
这项工作揭示了φR1-37基因组中表达了10种先前未注释的RNA种类(表1)。其中九个从无义链编码,因此是推定的反义RNA(asRNA)。剩下的小RNA编码在一个没有开放阅读框可能性的基因内区域。然而,数据并未证实先前推测的与g233反义的反义RNA种类。
表1. 已鉴定的新型非编码RNA种类。
| 名称 | 在基因组中的位置 | 链 | 相对于其他基因的位置 |
|---|---|---|---|
| misc_1 | 14,254-14,383 | - | 反义于g048的3‘端 |
| misc_2 | 17,805-18,199 | + | 反义于g055的5‘端和g056的3’端 |
| misc_3 | 32,500-32,820 | - | 反义于g077的5‘端 |
| misc_4 | 61,640-61,936 | + | 位于g099和g100之间的基因内区域 |
| misc_5 | 91,090-91,192 | - | 反义于g144的中部 |
| misc_6 | 103,380-103,720 | + | 反义于g157和g156的5‘端 |
| misc_7 | 148,610-148,960 | + | 反义于g207的5‘端 |
| misc_8 | 160,970-161,280 | + | 反义于g230的中部 |
| misc_9 | 217,379-217,553 | + | 反义于g295的中部 |
| misc_10 | 242,633-242,957 | - | 反义于g326的中部 |
(表格内容:列出了10个新型非编码RNA的名称、在基因组中的位置、链及其相对于其他基因的位置信息。其中misc_1到misc_10分别对应不同的位置,大部分为反义RNA,misc_4位于g099和g100之间的基因内区域。)
噬菌体基因组中存在小的非编码RNA(ncRNA)已被证实,但它们的作用尚不清楚。据推测,已鉴定的asRNA种类作为基因表达调控系统的补充成分,影响从有义链转录的噬菌体mRNA。小的asRNAs可能通过干扰有义RNA的转录来调节互补mRNA的表达。此外,asRNA种类可能通过覆盖内切核糖核酸酶E的单链结合位点来保护初级转录本,或者它们可能通过阻断核糖体结合位点来抑制mRNA的翻译。
也有可能是,基因内编码的misc_4小RNA(sRNA)种类靶向宿主mRNA。使用TargetRNA2进行的分析,阈值设置为p<0.001,结果指向三个宿主基因:编码蛋白酶III的ptr、编码延伸因子Tu的tufA和编码丙二醇利用二醇脱水酶再激活蛋白的ddrA。然而,在我们的研究中,这些基因均未显示差异表达。尽管如此,sRNA仍可能具有转录后效应,并通过影响mRNA的翻译来调节最终产物的产生。
3.6. YeO3-R1对φR1-37感染的转录反应
为了阐明宿主对φR1-37感染的反应,我们比较了感染前(阴性对照)与感染后早期(2-10分钟)和晚期(28-49分钟)时间点的细菌转录组(表S3和S4)。此外,为了更广泛地了解感染过程中宿主反应的变化,我们比较了感染早期和晚期阶段的细菌转录组(表S5)。早期细菌反应表明,大约2.58%(总共4349个基因中的112个)的小肠结肠炎耶尔森菌基因的转录水平在噬菌体感染后立即下降。只有很小一部分差异表达基因(七个基因)被上调。上调影响了一些参与能量和质子转运的膜蛋白,包括Na+/H+逆向转运蛋白NhaA(Y11_38431;Log2FC=+3.35)、甘油脱氢酶(Y11_37711;+3.09)、转录激活因子NhaR(Y11_38441;+2.10)、Mg2+转运蛋白C(Y11_14731;+1.75)和ATP合酶蛋白I(Y11_29681;+1.25)。在大量下调的基因中,受影响最显著的包括GntR家族的转录调节因子(Y11_21251;-3.81)、亚硝酸盐还原酶大亚基(Y11_32431;-3.24)、ADP-葡萄糖合酶(Y11_14901;-2.80)以及几种膜蛋白。这种类型的细菌反应与其他裂解性宿主-噬菌体系统并无不同,其中宿主基因的表达普遍下降。
