讨论
总体与活体土壤原核生物群落的差异
本研究发现，除碱性缓冲液洗涤法外，其他胞内DNA提取方法均显著降低了土壤原核生物多度（图1A）。该结果与多项研究一致，表明胞外DNA的存在可能导致原核生物多度的高估。碱性缓冲液洗涤的不一致结果主要归因于其促进微生物细胞裂解的能力。已有研究表明，碱性磷酸盐溶液洗涤可使DNA产量增加24%，从而抵消甚至逆转胞外DNA去除所导致的损失。此外，与其他方法相比，碱性缓冲液洗涤较低的胞外DNA去除效率也可能是导致上述不一致性的原因（图6）。
与许多研究相似，我们观察到16S rRNA基因拷贝数显著高于16S rDNA基因拷贝数（图1A）。这种差异源于rRNA与rDNA的内在固有差异，即单个rDNA分子可转录为多个rRNA分子。综上所述，土壤胞外DNA可能导致微生物多度的高估，而DNase预消化和PMA处理可有效缓解这一影响。与之前的一些研究相反，我们的研究表明，去除胞外DNA并未导致土壤原核生物丰富度的显著下降（图1B）。仅有采用DNase预消化法的分析才观察到显著的多样性减少（图1B），而且在基于总DNA提取所表征的原核生物群落中仅发现了75个特有的ASV（图S1）。这一矛盾主要归因于胞内DNA提取的土壤上样量不同。具体而言，一些研究仅使用0.03 g土壤进行胞内DNA提取，而本研究则使用了0.5 g土壤进行胞内DNA提取。我们最近的研究发现，DNA提取土壤用量不足会导致微生物丰富度被严重低估，这为本研究与之前研究的不一致性提供了合理解释。另一个值得注意的发现是，基于rRNA分析直接表征的土壤原核生物丰富度明显高于基于总DNA提取所表征的丰富度（图1B）。
这一差异的部分原因可能是转录错配和提取RNA时使用的土壤用量较高。此外，rRNA直接表征法对稀有物种的检测灵敏度较高，也可能是造成这种差异的原因之一。这些发现表明，胞外DNA对微生物多样性分析的影响在以前的研究中可能被夸大了。本研究发现，基于胞内DNA和总DNA提取所表征土壤原核生物的群落结构存在显著差异（图S4–S6），与多项研究一致，其主要原因为胞内外rDNA的固有差异，它们分别主要源自存活和死亡的微生物。微生物死亡通常由环境选择与随机过程驱动：环境选择方面，死亡微生物的环境适应能力通常低于活体微生物，从而导致死亡和存活微生物之间出现不同的群落结构；随机死亡虽与种群大小相关，但不同类群的随机死亡率差异仍可导致群落差异。此外，由于序列差异会影响胞外DNA的降解机率及其与土壤矿物质的吸附，胞外DNA的降解可能具有高度类群特异性，进一步加剧了胞内/外DNA所表征群落结构的差异。同时，rRNA和rDNA所表征的群落结构差异显著（图S6D），这一现象已被广泛报道，主要源于rRNA与rDNA的生态意义差异。
由此可见，胞外DNA对微生物群落分析的影响需谨慎评估。胞外DNA的去除显著简化了土壤原核生物的共现网络，但增强了网络鲁棒性（图3及表S2）。网络复杂度的降低主要源于群落多样性下降（图1），并且胞外DNA携带的历史生态足迹信息会增加网络的冗余连接。鲁棒性增强则可能与网络的模块化程度提高有关（表S2），同时网络内关键类群的变化也可能进一步影响鲁棒性。这些结果表明，基于总DNA提取的微生物分析高估了网络的复杂性，且低估了网络的鲁棒性。有趣的是，不同核酸提取方法所表征的土壤原核生物群落在构建机制上显示出高度的一致性（图4和S9）。因此，在大尺度土壤原核生物群落构建机制分析中，胞外DNA的影响可以忽略不计。
不同方法所表征活体原核生物群落的差异
与假说一致，本研究发现，不同方法所表征的土壤活体原核生物多度和多样性存在显著差异（图1、2和表S1）。这些差异主要归因于各方法胞外DNA去除效率和胞内DNA提取效率的差异（图5和图6）。例如，碱性缓冲液洗涤法的胞外DNA去除效率显著低于DNase预消化法（图6）。此外，各方法对不同原核生物类群的提取效率差异极大。例如，在大尺度比较实验和模拟群落实验中，PMA处理下芽孢杆菌属的相对多度均显著低于碱性缓冲液洗涤法（图2D和5C）。除此之外，如前所述，细胞rDNA和rRNA的含量具有不同的生态学意义。这可能是基于rRNA和胞内rDNA方法观察到的原核生物多度和多样性存在差异的主要原因。鉴于这些不一致性，在研究活体原核生物群落时必须考虑不同方法的可靠性。土壤质地与有机质含量是核酸提取效率的关键影响因素。例如，有机质含量高的土壤会增加提取液的黏度，从而可能阻碍细胞的有效裂解和核酸回收（图S7）；有机质还会干扰DNase活性，降低胞外DNA去除效率。土壤矿物与黏粒可能吸附核酸酶导致失活，降低其生物降解效率，这解释了DNase预消化法所表征群落与总群落的相似性与总有机碳（TOC）及黏粒含量的负相关（图S7）。粘土含量高或颗粒细小的土壤可能对胞外DNA有更强的吸附力，从而降低了DNA的可提取性（图S12）。这些因素可能导致不同类型土壤的提取效率存在显著差异，从而影响不同研究结果的可比性。碱性缓冲液洗涤法又称顺序提取法，是同时提取胞内和胞外DNA最广泛使用的方法。
本研究发现，该方法最大程度地减少了提取过程对活体原核生物群落结构解析的干扰（图5），但其去除胞外DNA的效果并不理想（图6）。事实上，多项研究指出，使用这种方法获得的胞外DNA比例远低于目前可接受的范围。值得注意的是，胞外DNA去除方法的效率会因土壤类型和环境条件的不同而有很大差异。例如，碱性缓冲液洗涤法在低pH土壤中效果较差，可能会导致胞外DNA的残留（图S12），会影响此类环境中微生物群落分析的准确性。因此，尽管碱性缓冲液洗涤法对胞内DNA提取干扰较小，但其胞外DNA去除效率低的问题限制了在活体微生物研究中的应用。PMA处理法在去除胞外DNA与提取胞内DNA方面效率较高（图5D及6），但其稳定性较差，即使是针对同一样本的技术重复（图5D及6）。此外，一些研究还强调了这种方法的不确定性。首先，对某些物种而言，PMA穿透其死亡微生物的细胞壁和细胞膜是个挑战。例如，死亡M.avium较厚的细胞壁和霉菌酸会在很大程度上阻止了PMA的穿透。其次，透光是PMA反应的必要条件，因此土壤浊液的高浊度会严重影响PMA反应。此外，一些研究使用极少量的土壤提取DNA来解决这一问题，但这可能会因土壤用量不足而导致微生物丰富度被低估。
最重要的是，一些研究发现PMA处理在反映复杂活体微生物群落方面存在严重的局限性。与碱性缓冲液洗涤法类似，PMA处理的效率也可能不稳定，尤其是在微生物群落复杂或土壤性质多变的土壤中（图S12）。因此，尽管PMA处理法是目前研究活体微生物最广泛使用的方法，但在解释基于该方法的结果时必须谨慎。我们建议针对特定的土壤类型进一步优化该方法，以提高其在实际应用中的可靠性和有效性。
在本研究中，DNase预消化法去除胞外DNA的效率最高，且对活体群落的表征准确性也可以接受（图5和图6）。该方法试剂成本低，培养时间短，对高通量测序过程的影响微乎其微，因此是一种有效且适合大尺度研究的方法。综上所述，我们推荐使用DNase预消化法提取土壤微生物胞内DNA，这是一种前景广阔、经济有效的方法。这些发现提供了宝贵的见解，可以推广到水生或沉积物等其他环境，并为提高不同生态系统微生物群落分析的准确性和可靠性奠定基础。目前，所有基于胞内DNA提取的方法均严重依赖于新鲜土壤。然而，微生物群落通常无法在鲜土中长期保持稳定，因此这些方法不适合时间跨度长和缺乏实时DNA提取条件的研究。幸运的是，rRNA直接表征法为解决这些难题提供了一种很有前景的选择。然而，其应用目前受到两个主要认知空缺。首先，土壤胞外rRNA的快速降解是使用这种方法研究活体微生物的必要前提。然而，土壤胞外rRNA的降解速率及其影响因素仍有待探索。其次，如上所述，基于rRNA直接表征的土壤微生物多度、多样性和群落结构与基于DNA的研究结果相比存在显著差异（图1、2和S6D）。然而，细胞rRNA含量的生态学影响仍存在很大争议。
因此，未来的研究工作应优先解决这些问题。尽管本研究结果提供了有价值的见解，但需要认识到可能影响研究结论的实验误差来源。这些误差来源包括样品处理、DNA提取和测序过程，每个环节都可能引入变异。例如，样本采集过程中的污染、DNA提取操作不当，或测序误差均可能影响结果的准确性。此外，针对每种土壤类型的各方法仅分析了一个重复样本，这限制了我们评估每种处理方法重复性的能力。在单一采样点进行重复取样将有助于解决这一局限性，并更清晰地揭示方法变异性。这些误差来源是任何涉及复杂生物样本的研究都固有的，在解释研究结果时应加以考虑。结论本研究表明，胞外DNA显著影响了土壤原核生物多度、多样性、群落结构与共现网络分析，但对群落构建机制的影响几乎可以忽略不计。我们还观察到，不同方法所表征的土壤活体原核生物多度、丰富度、群落结构和共现模式差异很大。
进一步的评估表明，碱性缓冲液洗涤可最大限度地减少提取过程对活体原核生物群落结构的影响，但其去除胞外DNA的效果较差，因此不建议使用。DNase预消化和PMA处理在去除土壤胞外DNA方面表现出很高的效率，其中DNase预消化在表征活体原核生物群落上表现出最高的整体效率和稳定性。虽然rRNA直接表征有望用于土壤活体微生物的研究，但目前对土壤微生物胞外rRNA降解速率和细胞rRNA含量的生态学意义的认知空缺，阻碍了其应用。
总之，本研究系统地比较和评估了研究土壤活体微生物的常用方法，为优化土壤微生物组研究方法提供了重要依据。
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