猪链球菌BirA与同源bioY基因的结合
不寻常的是，猪链球菌不具有从头生物素合成能力，因为这种人畜共患病原体缺乏在大肠杆菌和其他生物如农杆菌和副球菌中发现的生物素操纵子。然而，猪链球菌无法制造生物素似乎通过BioY介导的生物素摄取/清除途径得到补偿（图1和图7A）。此外，bioY基因座存在于人类病原体的其他两个近亲（粪肠球菌和乳酸乳球菌）中（图7A）。特别是，乳酸乳球菌编码两个版本的bioY基因以及两个BirA直系同源物（图7A），暗示了低GC含量革兰氏阳性细菌某些物种中生物素代谢的复杂性。
猪链球菌bioY基因的转录起始位点估计为“T”，位于翻译起始位点“ATG”前29 bp。生物信息学分析表明，猪链球菌bioY启动子区域存在一个推定的BirA结合位点（TTT TGT TAA CCA TAA AAT TTT AAG AGG ATA ACA A），覆盖转录起始位点（图7B）。鉴于上述观察，我们提出bioY可能受到猪链球菌BirA的负调控。虽然这个假设需要实验证据。我们使用含有预测位点的54 bp探针，使用电泳迁移率变动分析（凝胶变动分析）（图8A）测试了BirA结合bioY启动子的能力，如我们最近进行的略有修改。凝胶变动分析显示，猪链球菌BirA以剂量依赖的方式有效结合bioY探针（图8B），在存在0.5 pmol BirA的情况下，近100%的bioY探针转移到DNA-蛋白质复合物中（图8B）。鉴于来自相关生物的bioY启动子中BirA位点的明显保守性（图8A），我们还检查了BirA与不同来源bioY的可能串扰。事实上，发现猪链球菌BirA表现出与乳酸乳球菌（图8C）和粪肠球菌（图8D）的bioY探针相当的结合。它证明了BirA双功能蛋白与生物素转运蛋白编码基因bioY之间存在物理相互作用。
图7. birA（和bioY）的遗传组织和猪链球菌bioY启动子。（A）birA（和bioY）的遗传组织。birA（或称为birA1）和bioY（称为bioY1）的基因座分别以蓝色和黄色突出显示。蓝点表示预测的BirA结合位点。birA2和bioY2的基因座用灰色和紫色箭头表示。（B）猪链球菌bioY启动子。“S”表示推定的转录起始位点，红色的“ATG”是翻译起始位点。预测的BirA结合位点用下划线表示。
图8. BioY和BirA之间的相互作用。（A）BirA结合位点的多序列比对。（B）猪链球菌BirA蛋白与其自身bioY启动子结合。（C）猪链球菌BirA与乳酸乳球菌bioY启动子的结合。（D）猪链球菌BirA与粪肠球菌bioY启动子的相互作用。使用7%天然PAGE进行凝胶变动分析，并给出代表性照片。在每个分析中，BirA的水平用右侧的三角形表示（0.1，0.5，2和5 pmol），而所有DIG标记的探针（bioY_SS，bioY_LL和bioY_EF）均添加0.2 pmol。减号表示未添加BirA蛋白。指定：SS，猪链球菌；LL，乳酸乳球菌；EF，粪肠球菌。
生物素利用途径的生理意义
猪链球菌缺乏生物素合成，进化出BioY-BirA机制来利用从栖息地和/或感染宿主环境中清除的生物素，这是合理的（图1）。在猪链球菌血清型2的流行菌株05YH33中，三个涉及生物素代谢的基因分别是bioY（SSU05_0509）、birA（05SSU_1625）和accB（05SSU1801）。通过BirA生物素化后，AccB从其脱辅基形式转化为全形式，并参与脂肪酸生物合成的起始。鉴于BirA在生物素酰-5'-AMP（生物素生物素化的中间体）的帮助下结合bioY启动子，BirA蛋白的调控功能被认为可以保证在从外部环境摄取生物素后避免/最小化BioY转运蛋白的浪费产生。可能，对于链球菌/乳酸球菌的某些物种在脂质代谢的背景下，这是一个生理优势。为了测试上述预期，我们构建了猪链球菌的birA（△N）突变体，其中DNA结合结构域被框内删除（图9A，B）。去除N端DNA结合基序影响细菌在THB培养基上的生长，但这种生长缺陷可以通过补充5%脱纤维血液（或血液血清）来挽救（图9C，D）。然而，在birA（△N）突变体中，质粒携带的bioY启动子驱动的lacZ的表达与野生型相比没有显著改变（未显示）。这可能暗示BirA和bioY之间的相互作用代表了猪链球菌的一个发展中和/或退化系统。
图9. 猪链球菌的birA(△N)突变体。（A）从猪链球菌birA中框内删除N端DNA结合结构域的示意图。（B）猪链球菌birA(△N)突变体的PCR分析。（C）猪链球菌birA(△N)突变体在THB平板上的表型。（D）猪链球菌birA(△N)突变体在液体培养基中的表型。
结论
我们这里显示的数据定义了人畜共患病原体猪链球菌2型中生物素摄取/利用途径的工作模型（图1）。与在布鲁氏菌和副球菌中观察到的情况不同，其中bioY基因与BioR调节因子相互作用，我们的发现代表了链球菌/乳酸球菌中bioY和BirA之间相互作用的第一个例子。值得注意的是，在人类病原体布鲁氏菌的近亲植物病原体农杆菌中，bioY基因和BioR之间不存在反应。它暗示了细菌生物素代谢和调控的复杂性和多样性。
鉴于生物素合成基因bioJ和bpl2涉及细胞内病原体新凶手弗朗西斯菌的细菌毒力，探索生物素代谢在链球菌致病性中的可能作用非常有趣。虽然bioY和birA都是猪链球菌细菌存活所必需的，这论证了遗传去除两个生物素相关基因的技术可行性。据我们所知，生物素和硫辛酸都是生命三域所需的含硫维生素。类似地，LplA清除硫辛酸也是细胞内生长/存活和毒力所必需的。因此，我们筛选了猪链球菌05ZYH33的基因组序列，寻找编码硫辛酸蛋白连接酶的lplA基因的存在，给出了完美的命中（SSU05_1836）。我们计划检查其与细菌感染性的相关性。目前，似乎生物素和硫辛酸都是某些细菌病原体物种的营养毒力因子。鉴于猪链球菌2型是一种威胁公共卫生的新出现/再出现的传染源，我们的发现可能有助于更好地理解这种人畜共患病原体的生物学甚至感染。
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