[目的]本研究旨在明确纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[方法]以肺炎链球菌基因组中纤维二糖利用基因簇为参考，同源性比对分析猪源巴氏链球菌WUSP067中纤维二糖利用基因簇，通过荧光定量PCR(RT-qPCR)、RT-PCR、缺失株构建、不同条件下的生长曲线测定、小鼠毒力试验等评价其对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[结果]巴氏链球菌WUSP067基因组中存在2个潜在的纤维二糖利用相关基因簇(cellobiose locus，CL)，将其分别命名为CL1和CL2，它们均包括编码磷酸转移酶系统和β-葡萄糖苷酶的基因。RT-qPCR结果显示，与添加10 g·L-1葡萄糖的DMEM培养基相比，在添加10 g·L-1纤维二糖的DMEM培养基中，CL1中的BglP1wp和BglAwp基因表达量无显著差异，而CL2中celAwp和celBwp基因表达极显著上调(P<0.000 1)，分别上调49倍和33倍，提示其参与利用纤维二糖。选择CL2深入研究，RT-PCR结果显示，该基因簇由2个操纵子组成。构建编码β-葡萄糖苷酶的celAwp基因缺失株，生长曲线分析表明，野生株和celAwp基因缺失(ΔcelAwp)株在THB、DMEM+10 g·L-1 葡萄糖条件下生长情况无明显差异，但在DMEM+10 g·L-1纤维二糖条件下，野生株能以纤维二糖为唯一碳源生长，而ΔcelAwp表现出明显的生长缺陷，生长12 h时D600仍低于0.5。以断奶仔鼠为感染模型，比较野生株和ΔcelAwp株的毒力，每鼠攻毒剂量为3×108 CFU，野生株攻毒组小鼠3日内全部死亡，而ΔcelA株攻毒组的小鼠死亡趋势较缓，14 d后存活率为20%(P<0.05)。[结论]猪源巴氏链球菌WUSP067能以纤维二糖为唯一碳源生长，CL2是纤维二糖利用相关基因簇，其中celAwp基因不仅促进该菌利用纤维二糖，而且还影响该菌的毒力，在巴氏链球菌致病过程中发挥作用。
引言
巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)是一种革兰阳性球菌，曾属于牛链球菌生物型Ⅱ/2，后通过sodA(编码超氧化物歧化酶)基因系统发育树将其划分为一个新的物种即巴氏链球菌。该菌能感染包括鸽子、火鸡、鹅、牛、犬、猿和亚洲象等多种动物，主要引起败血症和脑膜炎症状，具有较高的死亡率。该菌也是人畜共患病原菌，可引致新生儿、老人和免疫缺陷患者心内膜炎、尿路感染和孕妇的宫内感染等症状，甚至死亡，还可能与人的胃肠道恶性肿瘤、肝癌有关。本课题组首次证实该菌可引致猪的脑膜炎，是猪链球菌病的新病原，由此建立了该菌的小鼠感染模型，且明确荚膜是重要的毒力因子; 此外，该菌还可定殖在表观健康猪的扁桃体和肺门淋巴结，且在不同地区检出率存在差异。目前，关于巴氏链球菌的报道主要是少量的流行病学数据，对其致病机制的了解十分有限。因此，深入研究巴氏链球菌致病机制具有重要科学意义。
纤维二糖是一种常见的β-葡萄糖苷，由2个葡萄糖构成，以β-1，4糖苷键连接，广泛存在于植物中，哺乳动物的日常饮食中含有纤维素，摄入后经肠道微生物降解产生纤维二糖。另外，哺乳动物胞外基质富含糖胺聚糖，当它降解时，会释放出纤维二糖的类似物。在大肠杆菌中，这些类似物会诱导纤维二糖相关基因的表达。病原菌在感染宿主过程中，纤维二糖是潜在的碳源，其有助于病原菌在宿主体内存活与增殖，肺炎克雷伯菌和艰难梭菌在感染过程中可以利用纤维二糖促进它们在肠道中的竞争优势进而增强毒力。肺炎链球菌中缺失纤维二糖利用相关基因BglA3(编码β-葡萄糖苷酶)导致该菌对小鼠的致病性下降。由此可见，纤维二糖利用在细菌感染致病过程中发挥重要的作用，而关于巴氏链球菌对纤维二糖利用的研究尚未见报道。
本研究以肺炎链球菌基因组中纤维二糖利用基因簇为参考，分析猪源巴氏链球菌WUSP067基因组中纤维二糖利用基因簇，通过荧光定量PCR、缺失株的构建、不同条件下生长曲线的测定、小鼠毒力试验等，评价其对巴氏链球菌生长及毒力的影响，为深入了解巴氏链球菌致病机制及该类疫病防控提供参考。