方法
细菌菌株和生长条件。 这里使用的细菌菌株包括大肠杆菌和猪链球菌（表1），所有大肠杆菌菌株均源自野生型K-12（表1）。两种培养基（Luria Bertani（LB）和丰富肉汤（RB））用于大肠杆菌，而Todd Hewitt Broth（THB）培养基用于猪链球菌。抗生素补充如下（mg/升）：氨苄青霉素钠，100；硫酸卡那霉素，50；和壮观霉素，100。
表1. 本研究中使用的细菌和质粒。
| 菌株或质粒 | 相关特征 | 来源 |
|---|---|---|
| 菌株 | ||
| Topolo | 大肠杆菌的克隆宿主 | Invitrogen |
| BL21(DE3) | 大肠杆菌的表达宿主 | 实验室库存 |
| BM4092 | 大肠杆菌的birA km突变体 | 4 |
| BM4062 | 大肠杆菌的birAts温度敏感突变体 | 4 |
| FYJ277 | 携带pET28a-birA_ss的Topo 10 | 本工作 |
| FYJ278 | 携带pBAD24-birA_ss的Topo 10 | 本工作 |
| FYJ279 | 携带pET28b-LLbccp87的BL21 | 本工作 |
| FYJ280 | 携带pET28a-birA_ss的BL21 | 本工作 |
| 05ZYH33 | 中国强毒SS2的流行菌株 | 实验室库存 |
| birA(△N) | 05ZYH33的birA突变体，缺乏N端DNA结合结构域 | 本工作 |
| 质粒 | ||
| pSET4s | 热敏自杀载体，SpcR | 45 |
| pET28a(+) | 用于在大肠杆菌中生产重组蛋白的T7启动子驱动表达载体 | Novagen |
| pBAD24 | 阿拉伯糖诱导型表达载体 | 51 |
| pET28a-birA_ss | 携带猪链球菌birA基因的pET28a | 本工作 |
| pBAD24-birA_ss | 编码猪链球菌birA基因的pBAD24衍生物 | 本工作 |
| pSET4s-UD | 用于框内删除猪链球菌birA N端结构域的pSET4s衍生物 | 本工作 |
质粒和遗传操作。 使用猪链球菌05ZYH33的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增birA基因（SSU05_1625），并克隆到表达载体pET28（a）中，得到重组质粒pET28-birA_ss（表1）。为了制备BirA蛋白，将表达质粒pET28-birA_ss转化到菌株BL21（DE3）中，得到菌株FYJ280（表1）。
此外，将birA_ss基因克隆到阿拉伯糖诱导型表达载体pBAD24中，得到质粒pBAD24-birA_ss。为了评估BirA的体内活性，应用了两个大肠杆菌birA突变体，分别称为birA km突变体菌株BM4092和温度敏感突变体BM4062（表1）。鉴于birA是一个双功能基因且为细菌存活所必需，在5'端删除birA的部分功能是合理的。因此，我们采用同源重组方法从猪链球菌05ZYH33的birA基因中去除N端DNA结合结构域，得到突变体birA（△N）（表1）。在这种情况下，应用了热敏自杀载体pSET4s。将猪链球菌bioY的启动子融合到无启动子的lacZ基因上，创建质粒携带的PbioY-lacZ融合（表1）。为了检查birA的体内作用，将PbioY-lacZ融合分别引入野生型菌株和猪链球菌的birA（△N）突变体中。所有获得的质粒均通过PCR分析和直接DNA测序验证。
BirA蛋白的表达和纯化。 使用携带28-birAss的大肠杆菌制备猪链球菌BirA的重组蛋白。用0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）在30°C下诱导细菌培养物3小时。将澄清的细菌上清液上样到镍亲和柱（Qiagen）上。用含有150 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱6x His标签的靶蛋白，并通过SDS-PAGE判断纯度。
液相色谱四极杆飞行时间质谱。 应用Waters Q-Tof API-US Quad-ToF质谱仪测定猪链球菌BirA（BirA_ss）蛋白的身份。将纯化的蛋白质条带从凝胶上切下，并用胰蛋白酶（G-Biosciences St. Louis, MO）消化，得到一组重叠肽，上样到Waters Atlantis C-18柱（0.03 mm颗粒，0.075 mm x 150 mm）上。获得的数据进行ms/ms分析。
体外Bio-5'-AMP合成和薄层色谱。 建立体外分析以测定BirA连接酶的蛋白质生物素化活性，如我们先前所述，略有修改。酶反应系统包括50 mM Tris-HCl（pH 8），5 mM三（2-羧乙基）膦，5mM MgCl2，20μM生物素，5μM ATP加16.5nM[α-32P]ATP，100mM KCl和2μM连接酶蛋白。将反应混合物在37°C下保持30分钟。为了弄清楚BirA连接酶的作用，平行保持两个反应管，其中一个补充AccB-87（50μM）。随后，将每个反应混合物的1μl点样到微晶纤维素纤维素薄层色谱板上，并在异丁酸-NH4OH-水（66:1:33体积比）中展开。将薄层色谱图干燥过夜，暴露于磷光成像板，并使用Fujifilm FLA-3000磷光成像仪可视化。
基于MALDI的BirA生物素化活性测定。 BirA催化的生物素化反应包括以下组分（100μM AccB-87，3μM连接酶，100μM生物素，1mM ATP，10mM MgCl2，100mM KCl，5mM三（2-羧乙基）膦，在50mM Tris-HCl（pH 8.0）中）。将反应在37°C下保持16小时，然后对25 mM乙酸铵透析，冻干至干燥。随后，使用基质辅助激光解吸/电离方法测定上述样品中AccB87的生物素化形式。
电泳迁移率变动分析。 进行凝胶变动实验以测试BirA蛋白与不同来源的bioY启动子的相互作用。通过退火两个互补寡核苷酸制备三组DNA探针（bioY_SS，bioY_LL和bioY_EF）（表2）。在EMSA试验中，将地高辛标记的DNA探针（~0.2 pmol）在结合缓冲液（Roche）中与纯化的BirA_ss蛋白孵育。必要时，补充生物素酰-5'-AMP配体。将DNA/蛋白质混合物用天然7% PAGE分离，并通过直接接触凝胶转移将膜转移到尼龙膜上，通过膜暴露于ECL胶片（Amersham）获得化学发光信号。
β-半乳糖苷酶分析。 将携带lacZ融合的猪链球菌的过夜培养物在THB培养基中生长，进行β-半乳糖苷酶活性的直接测量。必要时，添加血液血清以增强突变猪链球菌的细菌生长。使用French压力机制备细菌裂解物。数据记录三次以上三个独立分析。
生物信息学分析。 BirA蛋白的直系同源物分别来自大肠杆菌、乳酸乳球菌和猪链球菌05ZYH33。BirA结合位点从RegPrecise数据库收集。使用ClustalW2程序进行蛋白质（和/或DNA）的多重比对，最终输出通过ESPript 2.2程序给出。使用中性网络启动子预测服务器预测转录起始位点。使用CPHmodels 3.2服务器进行结构建模。
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