摘要
能够生物合成特异性角蛋白酶的角蛋白分解微生物因其在角蛋白废弃物管理中的潜在应用而成为科学关注的主题。在几个细菌类别中，放线菌仍然是角蛋白降解菌株的最重要来源之一，然而微球菌科的成员就其应用性角蛋白分解潜力而言很少受到仔细研究。从禽类羽毛废弃物中分离测试的微球菌属B1pz被鉴定为藤黄微球菌（M.luteus）。该菌株在含有1-2%鸡羽毛和酵母提取物补充剂的培养基中生长，产生32 KU的角蛋白酶和较低水平的蛋白酶（6 PU）。它能够有效分解羽毛或表皮角质层的"软"角蛋白，而其他"硬"毛发型角蛋白则不然。产生的角蛋白分解酶主要是碱性丝氨酸或硫醇蛋白酶的混合物，在最适pH 9.4、55°C下具有活性。在粗培养液中鉴定出四种主要的蛋白酶组分，分子量分别为62、185、139和229 kDa。对还原因子辅助作用的研究表明，还原性硫化合物可用于在角蛋白的酶消化过程中增强角蛋白分解，而不是在培养条件下。所展示的藤黄微球菌分离株表现出显著的角蛋白分解潜力，这决定了其在禽类副产品生物降解或角蛋白基饲料成分配制方面的可行应用能力。
引言
积累角蛋白废弃物的全球性问题（主要是作为屠宰场副产品）引发了对涉及多种角蛋白分解微生物的生物利用手段的科学兴趣。这种方法为当前采用的涉及高能耗技术或有毒试剂的生物转化方法提供了一种建设性替代方案。许多报告涉及放线菌角蛋白分解酶的主题，然而，绝大多数集中在链霉菌科成员，其中链霉菌属仍然是大量角蛋白酶生产者的无限来源。尽管如此，已知几种不太常见的放线菌表现出显著的角蛋白分解潜力。Thys等人描述的短小杆菌属（Microbacterium sp.）kr10，在以羽毛粉作为唯一营养源的情况下生长，据报道能在嗜温温度下产生角蛋白分解蛋白酶。一项详细调查揭示了一种42 kDa、含Zn²⁺、Mg²⁺的金属蛋白酶，对酪蛋白、白蛋白和角蛋白具有最高特异性。纯化的角蛋白酶在2-巯基乙酸盐存在下能有效水解天然角蛋白。如Mitsuiki等人所示，嗜碱的Nocardiopsis sp.TOA-1在脱脂牛奶/酵母提取物培养基上生长，生物合成了一种高度稳定的角蛋白分解酶，其最适活性在pH 11.0-11.5和70-75°C温度下。这种20 kDa的丝氨酸蛋白酶对角蛋白表现出高特异性活性，对酪蛋白的活性较低。
从几个禽类养殖场来源的筛选放线菌中，Saha等人获得了一种羽毛降解的Nocardiopsis sp.SD5，能够在高度碱性条件下，在淀粉/酪蛋白培养基上培养4天内，有效利用角蛋白（45-50°C）。粗角蛋白酶提取物对天然羽毛显示出巨大的活性。酶谱分析揭示了30 kDa和60 kDa两种蛋白水解组分的存在。也有关于新型角蛋白分解放线菌属于Amycolatopsis或Actinomadura属的报告。普遍存在的微球菌属细菌是已知的细胞外丝氨酸或硫醇蛋白酶以及弹性蛋白酶的生产者。
然而，微球菌细菌的真正角蛋白分解潜力很少被提及和被低估。虽然一些致病菌株负责某些皮肤感染，但其他菌株可以作为角蛋白分解酶的宝贵来源或有助于角蛋白废弃物管理。密切相关的玫瑰色库克菌（Kocuria rosea）经Bernal等人深入研究，是羽毛诱导角蛋白酶的杰出生产者的例子。该菌株在含有3%羽毛的批次培养物中，在补充了酵母提取物的优化矿物质培养基中，于40°C下生物合成角蛋白分解和酪蛋白分解蛋白酶。玫瑰色库克菌的独特特性使作者能够设计一个发酵过程，以提高废弃羽毛的生物价值，用作动物饲料成分。
角蛋白的微生物分解已知不仅由特定的蛋白水解酶进行，还涉及负责底物中二硫键断裂的还原因子。硫化合物如亚硫酸盐或硫化物，以及二硫键还原酶，已知是此过程的一部分（Yamamura et al.，2002;Prakash et al.，2010;Cedrola et al.，2012）。因此，研究微生物生长环境中还原因子的存在，以及补充二硫键还原剂在改善角蛋白分解中的可行性变得至关重要。
本研究旨在通过评估角蛋白酶生产条件、角蛋白生物降解能力、粗培养液中蛋白酶和角蛋白酶的初步表征，以及研究还原因子在角蛋白分解增强中的作用，来评估微球菌属B1pz细菌的角蛋白分解潜力。
材料与方法
细菌菌株和分子系统发育研究
该细菌菌株在先前的研究中从波兰弗罗茨瓦夫附近的家禽加工厂的羽毛废弃物中分离，并保藏于波兰弗罗茨瓦夫环境与生命科学大学生物技术与食品微生物学系的本地菌种保藏中心。从营养肉汤（葡萄糖10 g/L；营养肉汤8 g/L）的24小时液体培养物中，使用GeneMATRIX细菌和酵母基因组DNA纯化试剂盒（Eurx）提取基因组DNA。使用以下通用引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增16S rRNA基因：（27 F）AGAGTTTGATCGTGGCTCAG和（1492L R）GGTTACCTTGTTACGACT。PCR反应混合物（50μL）包含：25μL Taq PCR Master Mix（2x）（Eurx）；每种引物20 pmol和基因组DNA 1mu g。
PCR程序包括：94°C初始变性5分钟，随后进行35个循环：94°C变性1分钟，53°C退火30秒，72°C延伸90秒，最后72°C延伸10分钟。PCR产物从反应组分中纯化，并使用引物：27 F、1492L R和一个额外的内部引物CTCCTACGGGAGGCAGCAG（357 F）进行测序。获得的序列提交至核糖体数据库项目（RDP）第10版。使用MAFT版本6和Archaeopteryx版本0.972+进行序列比对和系统发育研究。
角蛋白材料
实验中使用的角蛋白是各种皮肤附属物，如白鸡羽毛、白鸵鸟羽毛的羽枝和羽轴、猪鬃、羔羊毛、人发和表皮角质层（s.c.）。底物通过用甲醇-氯仿溶液（1:1）洗涤和脱脂制备。
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