结果
本研究所采用的关于VTEC（产志贺毒素大肠杆菌）在发酵生肉制品（FRMS）生产与贮藏相关环境条件下响应的数据，涵盖了多种血清型与菌株。尽管数据生成条件多样，且涉及大量不同的血清型与菌株，但我们的联合数据集呈现出良好的一致性趋势。所构建的模型已成功通过新的实验观察结果以及来自文献和公共数据库的独立数据进行了验证。
模型开发
(i)生长速率模型
模型预测的生长速率与在不同温度、pH和水分活度（a_w）条件下观测到的生长速率进行了比较。基于这三个环境因子构建的核心模型，进一步通过引入未解离乳酸浓度的影响项进行了扩展，该扩展项的参数拟合基于本研究生成的数据。表2列出了所估计的模型参数值。与先前对单核细胞增生李斯特菌的报道类似，我们在大肠杆菌中也观察到，生长速率的自然对数所受的抑制与未解离乳酸浓度成正比，且此关系独立于pH或总乳酸浓度。
表2 - 模型系数估计值与标准误表2 模型系数估计值与标准误| 模型、建模量及方程 | 系数或其他参数 | 估计值 | 标准误 (SE) |
|---|---|---|---|
| 最大比生长速率 (μmax), ln(μmax), 方程 4 | a0 | -9.95 | 1.25 |
| a1 | 0.188 | 0.0584 | |
| a2 | 1.89 | 0.253 | |
| a3 | -3.65 | 4.22 | |
| a12 | 0.0290 | 0.00789 | |
| a13 | -0.279 | 0.0955 | |
| a23 | 4.55 | 0.572 | |
| a11 | -0.00514 | 0.000295 | |
| a22 | -0.223 | 0.0184 | |
| a33 | -131 | 8.81 | |
| a4 | -0.146 | 0.0167 | |
| RMSEa | 0.307 | - | |
| a RMSE, 均方根误差。 | |||
| 非热比灭活速率 (φ), ln(φ), 方程 5 | b0 | 23.4 | 1.96 |
| b1 | -8000 | 567 | |
| F | -1.51 | - | |
| b4 | 0.00796 | 0.000737 | |
| RMSE | 0.693 | - | |
| 热比灭活速率 (τ), ln(τ), 方程 6 | c0 | -20.3 | 1.61 |
| c1 | 0.391 | 0.0281 | |
| RMSE | 0.267 | - | |
| 生长概率 (P), ln(P/(1-P)), 方程 7 | d0 | 21.3 | 1.26 |
| d3 | 7.38 | 0.468 | |
| d12 | 0.642 | 0.157 | |
| d13 | -0.583 | 0.0521 | |
| d23 | -0.496 | 0.121 | |
| d4 | 16.5 | - | |
| 一致性b | 97.2% | - | |
| AICc | 660 | - | |
|
b 预测概率与观察响应之间的一致性。 c AIC, 赤池信息准则。 |
|||
(ii)生长概率模型
通过逻辑回归方法，构建了描述生长概率对温度、pH和a_w依赖关系的模型。采用向后回归系数选择法进行变量筛选，结果表明，初始包含的10个模型项中有5项不显著，故将其从最终模型中剔除。模型系数见表2。该模型随后通过引入第四个环境因子——未解离乳酸浓度的影响项进行了扩展。乳酸添加显著改变了生长概率为0.5的预测边界条件。在不含乳酸的情况下，生长/不生长的边界pH值约为4；而当培养基中添加总乳酸浓度达到45,000 ppm时，边界pH值上升至6。
为探究模型在不同乳酸浓度、温度、pH和a_w组合下的性能，本研究生成了一套新的数据集。总体而言，包含乳酸影响项的扩展模型预测结果与独立生成的生长/不生长数据吻合良好。估计扩展模型（含乳酸项）的预测与观测响应之间的一致性百分比为86%，而原始模型（不含乳酸项）的一致性为77%。
(iii)存活/非热灭活速率模型
在此上下文中，“存活”或“非热灭活”特指在FRMS特有的环境条件下（即温度以外的其他因素，如低pH或低a_w，阻止了大肠杆菌生长）菌群数量的衰减。为研究种群衰减速率对温度、pH和a_w的依赖性而开发的核心模型表明，只有温度对大肠杆菌的灭活速率具有显著影响。因此，当其他因素（如低pH和/或低a_w）抑制大肠杆菌生长时，灭活速率主要依赖于温度，并在较小程度上依赖于未解离乳酸浓度。这些抑制生长因素本身（pH和a_w）并非直接导致灭活速率变化的主因。
为研究未解离乳酸浓度对大肠杆菌非热灭活的影响，我们生成了一套新的数据集，包含96条存活曲线，涉及两种大肠杆菌血清型（O157:H7和O103:H25），在多种乳酸浓度、温度、pH和a_w组合下进行。这两种血清型灭活速率的比较表明，大肠杆菌O103:H25的衰减速率显著高于O157:H7（P值<0.0001）。大肠杆菌O157:H7表现出更强的抗灭活能力，尤其是在低pH条件下。初始的非热灭活模型在最苛刻条件下预测的灭活速率快于该菌株的实际观测值。因此，我们对模型进行了修正，使其能够基于本研究中发现的抗性最强的菌株（O157:H7）来预测VTEC的存活情况。修正方法是在模型中引入一个因子F，该因子根据模型预测值与O157:H7实测灭活速率之间的偏差计算得出。利用该菌株生成的数据也用于通过乳酸影响项扩展VTEC的非热灭活模型。
本工作开发的非热灭活速率模型与McQuestin等人的模型存在差异。这主要是由于本研究模型引入了校正因子，使其能够基于最具抗性的菌株进行预测。在较高温度下，本研究模型预测的灭活速率比McQuestin等人的模型预测值低达40%。先前一项使用相同VTEC菌株的研究也报道了McQuestin模型预测值与观测非热灭活速率之间的类似差异。
(iv)热灭活速率模型
当温度高于约47°C时，温度本身对大肠杆菌产生致死效应，因此需要开发热灭活模型。我们构建了一个热灭活模型来描述温度对大肠杆菌的致死效应。为此，将ComBase数据库中报告的、在49°C至55°C和pH 7条件下测量的热灭活速率，与萨拉米香肠在相同温度和pH下报告的结果进行了比较。该数据集被用于拟合热灭活模型的参数（表2）。
模型验证
(i)生长速率与生长概率模型验证
我们将本模型的生长速率预测结果与Ross等人开发的大肠杆菌生长速率模型预测进行了比较。Ross等人的模型平均预测生长速率高出约50%。这种差异可能源于数据生成方法和生长速率估算方式的不同。通过分析误差的偏差和随机变异组成部分，在考虑系统差异后，我们的模型表现出可比的性能。
生长概率模型的验证表明，扩展模型（包含乳酸影响项）与观测数据的一致性（86%）优于原始模型（77%）。预测的生长/不生长边界条件与独立数据集吻合良好，证实了模型的有效性。
(ii)在中试工厂生产的VTEC污染FRMS中大肠杆菌浓度的模型验证
将EcSF工具预测的VTEC浓度与在中试工厂生产的挪威香肠和瑞典梅特沃斯特香肠整个生产和贮藏过程中观测到的浓度进行了比较。总体而言，模型预测的浓度与所有VTEC曲线在整个FRMS制备和贮藏过程中的观测值高度吻合，差异百分比在3%至16%之间。在发酵兼成熟期内，VTEC浓度减少了约1个对数单位。最大的VTEC减少量出现在高温贮藏阶段，如在25°C下贮藏66天后，VTEC减少量超过6个对数单位。
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