2.2.通过RAPD-PCR进行菌株分型
对于每个分离株，将生长在MRS琼脂上的一环细胞悬浮在200μl的6%Chelex®-100（Bio-Rad，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国）中，在100°C加热10分钟，冰上冷却，并在14,000 g下离心10分钟。使用50微升上清液（含有DNA）作为PCR模板。使用随机引物KS、M13R2、R5和CC1进行RAPD-PCR分析（表1）。每个25-μl PCR反应包含2.5μl的10x PCR缓冲液，3.5 mmol l-1的MgCl2，0.2 mmol l-1的每种dNTP，0.8μmol l-1的引物，1 mg ml-1的BSA，1 U的TAQ聚合酶（Invitrogen，梅勒尔贝克，比利时）和2μl的DNA。
| 引物 | 序列(5'-3') | 靶基因 | 参考文献 | 退火温度(°C) | 循环数 |
|---|---|---|---|---|---|
| M13R2 | GGAAACAGCTATGACCATGA | 随机引物 | Martin et al. (2005a) | 38 | 40 |
| KS | TCGAGGTCGACGGTATCG | 随机引物 | Fulladosa et al. (2010) | 40 | 40 |
| CC1 | AGCAGCGTGG | 随机引物 | Cocconcelli et al. (1995) | 33 | 40 |
| R5 | AACGCGCAAC | 随机引物 | Martin et al. (2005a) | 29 | 40 |
| BSF8 | AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG | 16S rRNA | 通用引物 | 50 | 40 |
| BSF 343 | TACGGGAGGAGCAG | ||||
| BSF1541 | AAGGAGGTGATCCAGCCGCA | ||||
| sodA1 | CCITAYICITATYAYGAYGCIYTIGARCC | sodA | Poyart et al. (2000) | 37 | 35 |
| sodA2 | ARRTARTAIGCTGCYTCCCAIACRTC | ||||
| H729 | CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC | cpn60 | Brousseau et al. (2001) | 50 | 40 |
| H730 | AGCGGATAACAATTTCACACAGGAYKITYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | ||||
| M13(-40)F | CGCCAGGGTTTCCCAGTCACGACGAC | 50 | 25 | ||
| pheS-21-F | CAYCCNCGHCGYGAYATGC | pheS | Naser et al. (2005) | 46 | 35 |
| pheS-22-R | CCWARVCCRAARGCAAARCC | ||||
| phe-S23-R | GGRTGRACCATVCCNGCHCC | 50 | 25 |
扩增程序包括在95°C下2分钟，以及40个循环的变性在95°C下30秒（对于M13R2和KS）或1分钟（对于CC1和R5），退火1分钟（表1）和延伸在72°C下（M13R2和KS为1.5分钟，CC1和R5为2分钟），随后在72°C下进行最终延伸5分钟（引物M13R2）或7分钟（引物KS、CC1和R5）。使用GeneAmp PCR System 2700（Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亚州，美国）。
PCR产物通过QIAxcel系统（QIAGEN，Hidden，德国）使用DNA筛查盒和AM320分离方法进行分离。使用InfoQuestTM FP软件版本4.5（Bio-Rad Laboratories，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国）对RAPD图谱进行归一化和分析。来自同一个婴儿的分离株在RAPD分析中显示相同条带模式的被认为属于同一基因型。
2.3.分离株的鉴定
每种基因型的一个或两个分离株通过测序16S rRNA的V1-V3区域进行鉴定。不能在物种水平上鉴定的肠球菌属、乳酸杆菌属和魏斯氏菌属，通过cpn60和/或pheS测序进行鉴定。链球菌物种通过sodA测序鉴定。每个50μl PCR反应包含5μl的10x PCR缓冲液，1.5 mmol l-1的MgCl2，0.4 mmol l-1的每种dNTP，0.5μmol l-1的每种引物（表1），2 U的TAQ聚合酶（Invitrogen）和5μl的Chelex®-100纯化的DNA。使用Qiacube设备和QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化扩增子，并用BigDye Terminator 3.1循环测序试剂盒（Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亚州，美国）扩增5 ng。在ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）上进行测序。使用欧洲生物信息学研究所的在线BLAST-W2和ClustalW分析序列。
2.4.生长测定
使用Bioscreen C（Oy Growth Curves Ab Ltd，赫尔辛基，芬兰）测试乳酸杆菌菌株的生长，使用以下肉汤：MRS-c（2%-葡萄糖MRS（Merck））、MRS-Salt（2%-葡萄糖MRS+2.5%w/v NaCl）、MRS-Nit（2%-葡萄糖MRS+150 ppm NaNO2）和MRS-mix（0.7%-葡萄糖MRS+2.5%w/v NaCl+150 ppm NaNO2）。所有肉汤都调节至pH 5.7。将乳酸杆菌的过夜培养物（37°C培养20小时）在相应培养基（MRS-c、MRS-Salt、MRS-Nit或MRS-Mix）中稀释至10^6-10^7 CFU/ml，基于其OD600 nm值。将400μl等分试样转移到Bioscreen C板的孔中，每个样品做三个重复。将板在Bioscreen C中于37°C（MRS-c、MRS-Salt和MRS-Nit）或20°C（MRS-c、MRS-Salt、MRS-Nit和MRS-mix）运行，直到微生物达到稳定期。为了尽量减少氧气存在，用硅胶密封孔盖。每30分钟测量一次OD600 nm。对每种肉汤和培养温度进行了三次独立实验。使用DMFit程序将生长数据调整到Baranyi和Roberts数学模型，获得生长速率和延迟期等动力学参数。对于所有曲线，确定了检测时间（TTD），即OD600 nm增加0.05所需的时间。
另外，研究了在含有和不添加黑胡椒（3 g/kg）的MRS肉汤（Merck）中以1%接种的乳酸杆菌在37°C培养24小时期间的生长情况。在开始培养后以及培养6小时和24小时后在MRS琼脂（Merck）上进行平板计数。