讨论
在这项研究中，我们证明中性粒细胞对不同细菌病原体的反应存在显著差异。将人原代中性粒细胞暴露于从严重脓毒症/脓毒性休克病例中分离的不同临床菌株，并通过测量两种脓毒症相关因子HBP和抵抗素来评估脱颗粒。刺激实验显示，链球菌菌株，不仅包括GAS，还包括GBS、GCS、GGS和草绿色链球菌以及链球菌M1蛋白，是HBP和抵抗素释放的有效触发剂，而金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和LPS都是弱诱导剂。尽管与链球菌菌株相比LPS是弱诱导剂，但应注意抵抗素释放的幅度与其他研究中报道的相当。此外，TLR激动剂LPS的这种相对较弱的效果与先前的报告一致，表明尽管LPS具有启动效应，但它是中性粒细胞胞吐的弱激动剂。
此外，从细菌培养物制备的上清液未能诱导任何HBP或抵抗素释放。因此，在链球菌细菌激活的情况下，我们的数据表明表面相关因子，而不是分泌因子，参与触发中性粒细胞脱颗粒。然而应注意，在先前的一份报告中，观察到用GAS过夜培养上清液刺激后HBP释放，但仅由含有高浓度链球菌溶血素O的上清液引起。因此我们不能排除由上清液诱导的反应缺失可能是由于本研究中使用的菌株SLO产量低。这也提出了体外毒力因子表达与患者体内表达比较的问题。患者的体液反应表明超抗原和链球菌溶血素被产生，但没有关于其浓度的数据。这里我们使用含有分泌毒力因子混合物的上清液，因为这是我们在技术上能复现的最接近临床环境的情况。同样，活菌感染具有临床相关性；然而，在本研究中，灭活细菌被认为是比较触发中性粒细胞活化的细菌因子所必需的。活菌感染会伴随混杂因素，如不同程度的吞噬作用、细胞内复制以及毒素介导的细胞毒性，这将使解释复杂化。
先前关于链球菌菌株激活中性粒细胞的报告集中于GAS，特别是链球菌M蛋白，其可溶性形式被确定为中性粒细胞活化和脱颗粒的关键触发因子。Herwald等人阐明了潜在机制，并表明它涉及与纤维蛋白原形成复合物以及随后的β2-整合素结合。在本研究中，测试了不同类型的菌株，包括T1（与emm1/M1血清型相关）以及T4和T28型。后两种类型都表达M相关蛋白MRP4，与M1蛋白类似，具有两个纤维蛋白原结合位点。链球菌菌株通常表达纤维蛋白原结合蛋白，在GAS、GBS、GCS和GGS中，这些蛋白主要由M/M样蛋白家族成员组成。在草绿色链球菌中，已鉴定出一种具有纤维蛋白原结合能力的噬菌体裂解酶。因此，链球菌表面相关M蛋白和其他纤维蛋白原结合蛋白代表了可能有助于观察到的中性粒细胞活化的推定候选物。
然而，使用M1缺陷GAS菌株的实验仅导致反应轻微减少；因此表明表面附着的M蛋白不是主要触发因素，或者存在多种链球菌因子。链球菌表面附着因子包括M和M样蛋白、菌毛结构和细胞外基质结合蛋白，如纤连蛋白和胶原结合蛋白，受基因调节系统控制。因此，我们测试了缺乏基因调节系统的细菌突变体，包括Mga（它是影响emm和emm样基因的调节因子），以及MsmR和Ralp3（影响编码纤连蛋白和胶原结合蛋白以及T菌毛的FCT基因座）。与M1突变菌株类似，删除Mga并未损害刺激能力。此外，Ralp3敲除菌株中Mga操纵子转录本丰度降低和FCT基因座转录增加，更强调了FCT区域蛋白而非emm和emm样基因参与中性粒细胞活化。
此外，MsmR缺陷菌株触发的反应降低。在msmR和ralp3突变体中，几个基因差异表达，包括编码纤连蛋白结合蛋白F2和胶原结合蛋白的基因。prtF2和cpa在msmR突变体中均下调，而在ralp3突变体中上调。尽管msmR突变体的刺激能力降低，表明FCT区域蛋白作为中性粒细胞激活剂参与，但它仍然触发了显著的激活。总之，这暗示多种因子参与链球菌触发的中性粒细胞活化。使用药理学抑制剂和封闭抗体阻断信号转导通路的尝试也揭示了Src家族激酶和TLR2在链球菌中性粒细胞活化和脱颗粒中的作用；然而，阻断效果远非完全，这是预期的，如果涉及几种细菌配体并与多个受体相互作用。
研究揭示了显著的个体间差异，特别是在供体之间的HBP反应中，有些是低反应者，其他是高反应者。HBP（而非抵抗素）反应完全依赖于血浆的存在，并且与先前的报告一致，GAS刺激后HBP释放的供体变异似乎与抗M蛋白抗体的存在或缺失有关。在Kahn等人的报告中，提出高反应与针对M蛋白中心区域的抗体存在有关，导致含有M蛋白、纤维蛋白原和IgG的复合物，通过Fc受体和β2-整合素的双重结合触发HBP释放。在我们的研究中，高反应者不仅对M1蛋白和GAS菌株反应强烈，而且对GBS、GCS、GGS和草绿色链球菌也反应强烈。目前，这种对链球菌菌株普遍高反应的潜在机制仍有待阐明，但由于M和M样蛋白在中心区域具有同源性，很容易推测效应可能与交叉反应抗体有关。值得注意的是，链球菌菌株在所有供体中触发抵抗素释放，而供体变异仅与HBP释放相关；因此，表明HBP和抵抗素的胞吐作用涉及不同的受体和/或信号转导通路。
通过刺激细胞细胞内免疫染色随后共聚焦显微镜观察颗粒内容物显示，HBP和抵抗素主要定位于不同的颗粒中，其中许多是MPO阳性嗜苯胺蓝颗粒。值得注意的是，在激活后，用链球菌M1蛋白刺激的细胞中HBP和抵抗素的共定位显著增加，但用LPS或fMLP刺激则没有。此外，颗粒显得更大，这表明响应M1蛋白，HBP和抵抗素阳性颗粒被动员。结合相似的反应动力学曲线，数据表明响应链球菌刺激，这两种因子同步释放。这通过分析脓毒性休克队列中的HBP和抵抗素反应得到进一步支持。所有脓毒性休克患者的血浆HBP和抵抗素水平均较非感染危重患者升高，并且在所有患者队列（即革兰氏阳性和革兰氏阴性感染，GAS引起的STSS）中发现血浆HBP和抵抗素水平呈正相关。然而，在STSS队列中，无论是在全身血浆中还是在软组织活检中，相关性尤其显著。由于先前尚未探讨这两种效应分子共存可能如何影响炎症，我们还测试了PBMC对HBP和抵抗素单独或组合的反应。结果表明，暴露于两种因子组合的细胞响应显著更高的炎症反应，通过IL-8释放确定。值得注意的是，对患者IL-8水平的测量显示，在STSS患者中IL8与HBP和抵抗素分别呈正相关，但在大型脓毒症队列中没有。
总之，数据支持中性粒细胞活化因细菌刺激物而异的概念，这可能具有临床意义。考虑到本研究中测试的链球菌菌株具有更大的刺激能力，中性粒细胞活化和脱颗粒可能在链球菌感染的病理学中起核心作用似乎合理。这对治疗策略具有重要意义，特别是考虑到几项试验试图增强脓毒症中的中性粒细胞募集和功能。就此而言，我们的数据强调了对此主题进行进一步研究的重要性，以深入了解最可能从中性粒细胞调节中受益的患者群体。
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