链球菌M1蛋白从AP1衍生的等基因突变体MC25菌株纯化，如先前所述。使用了商业可得的来自大肠杆菌的LPS。
抗菌活性测定。化脓性链球菌（T1菌株）、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在37°C液体培养基中培养过夜。将培养物稀释（化脓性链球菌1:50，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1:180）。为了确定HBP和抵抗素的抗菌效果，将细菌培养物暴露于不同浓度的肽。测试了HBP的最终浓度5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml，以及抵抗素的最终浓度2μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml。基于在420-580 nm处的浊度测量，使用Bioscreen C在24小时内生成光密度曲线。每15分钟测量一次，数据导出到PC。使用GraphPad Prism version 6.0 for Mac分析数据。
人原代细胞的感染和刺激。通过Polymorphprep或Ficoll-Hypaque梯度离心从健康个体静脉血中分离人中性粒细胞和外周血单核细胞。将细胞重悬于补充有5% FCS、10mM L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和25 mmol/L HEPES的RPMI-1640中。将5 x 10^6 中性粒细胞/ml用链球菌M1蛋白、LPS（从大肠杆菌提取）、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯、N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸，或用灭活细菌或细菌上清液（1:50和1:500稀释）刺激。在抑制分子或受体的情况下，将分离的中性粒细胞与10μM抑制剂或10μg封闭抗体预孵育30分钟。
灭活细菌的剂量基于剂量反应实验选择，该实验显示在较宽的感染复数范围内反应稳定。链球菌M1蛋白和LPS的浓度也基于剂量反应实验选择，其中0.5或1μg/ml对M1刺激产生峰值反应，而LPS在50 ng/ml-1μg/ml范围内显示相同反应。将链球菌M1蛋白、细菌上清液和灭活细菌与10%自体血浆在37°C预孵育10分钟，以允许纤维蛋白原复合物形成，如先前所述。在确定的时间点，离心细胞并收集无细胞培养上清液用于分析。
将PBMC（1 x 10^6 细胞/ml）用HBP和抵抗素，每种因子单独和组合刺激2小时，然后收集培养上清液。
使用了以下封闭抗体和药理学抑制剂：抗β2整合素、抗TLR2、LY294002 (PI3K)、PD98059 (ERK1/2)、SB203580 (MAPK p38)、PP1 (Src家族激酶) 和 SP600125 (JNK)。选择这些特定分子是因为蛋白质磷酸化是中性粒细胞激活的关键步骤，并且Src家族酪氨酸激酶已涉及控制人中性粒细胞的颗粒胞吐。
斑点印迹测定。将链球菌M1蛋白或PBS（阴性对照）点样到PVDF膜上，吸收30分钟。随后用含0.1% Tween的PBS溶液洗涤M1蛋白探测的膜，并用5%脱脂牛奶/PBST封闭2小时。封闭后，洗涤膜并与供体血浆（用2.5%脱脂牛奶/PBST稀释1:10）在4°C孵育过夜。过夜孵育后，仔细洗涤膜并与辣根过氧化物酶标记的二抗抗人IgG抗体孵育。使用电化学发光试剂盒显影。作为阳性对照，将膜与抗M1兔血清孵育并使用抗兔IgG检测。使用发光图像分析仪评估强度，并使用Multi Gauge软件版本3.2定量。
分泌的HBP、抵抗素和IL-8的分析。通过ELISA分析HBP，如先前所述。根据制造商说明书，使用商业可得的ELISA分析抵抗素。通过Luminex分析测量IL-8水平。
组织活检和原代人细胞的免疫染色。将速冻活检切片、固定、免疫染色，并如先前所述进行分析。通过获取计算机图像分析分析整个切片。结果表示为ACIA值，等于阳性染色面积百分比乘以阳性染色平均强度。
将刺激的中性粒细胞用2%多聚甲醛固定10分钟，用PBS洗涤，并使用细胞离心涂片机添加到玻璃盖玻片上。进行三重免疫荧光染色如下；细胞使用0.1%皂苷/PBS透化，并最初在37°C用2% FCS/PBS-皂苷封闭5分钟。随后用0.1% BSA-c/PBS-皂苷封闭30分钟，之后加入一抗在37°C孵育30分钟。在加入荧光染料标记的二抗之前，用1%正常山羊血清/PBS-皂苷封闭细胞30分钟。二抗在黑暗中孵育30分钟。
使用了以下抗体：抗中性粒细胞弹性蛋白酶；抗CD68；抗抵抗素；抗MPO；以及二抗驴抗小鼠IgG-Alexa488、驴抗兔IgG-Alexa546和驴抗山羊IgG-Alexa647。使用多克隆抗HBP兔血清纯化的IgG或单克隆抗HBP小鼠血清纯化的IgG鉴定HBP。
使用尼康A1R共聚焦显微镜进行评估。使用100倍油镜计划复消色差物镜获取3-5个视场的Z-栈。
共定位分析。使用Imaris 3-D图像分析版本7.6.3分析Z-栈图像。然后应用Imaris细胞功能，基于用户定义的大小和强度阈值自动定位细胞内的囊泡。通过掩蔽每个 respective 囊泡类型，为每个标记创建新通道，进行共定位测量。测量共定位体素总数，并通过使用图像散点图的正交回归分析结合Pearson系数方法自动计算阈值。
统计评估。使用GraphPad Prism version 4.0 for Windows分析数据。使用Mann-Whitney U检验、Wilcoxon匹配对符号秩检验或Kruskal Wallis检验与Dunns检验进行组间比较。通过使用Pearson相关性检验或，在数据非高斯分布的情况下，Spearman等级相关系数确定变量之间的相关性。当p<0.05时认为差异显著。
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