摘要
合成了由交替的亲水性和疏水性氨基酸组成的头尾环状多肽，并测试了其对具有重要经济价值的植物病原细菌的解淀粉欧文氏菌、辣椒斑点病菌和丁香假单胞菌的活性。评估了抗菌活性、对人红细胞的细胞毒性以及对蛋白酶降解的稳定性。研究了环化、环大小以及用D-Phe替换L-Phe对抗菌和溶血活性的影响，并将其与结构化和疏水性程度相关联。我们的结果表明，线性多肽对测试的三种细菌均无活性。环状多肽仅对辣椒斑点病菌和丁香假单胞菌有活性，其中c为最活跃的多肽，对辣椒斑点病菌和丁香假单胞菌的最小抑菌浓度值分别为6.25和12.5μM。环状多肽与其线性对应物相比抗菌活性的提高与疏水性增加和二级结构含量增加相关，这二者又与增强的两亲性有关。当在环状序列中引入D-Phe时，观察到抗菌和溶血活性降低，这归因于它们的低两亲性，如其低二级结构含量和低保留时间所示。最佳多肽的小尺寸、简单结构、杀菌效果和对蛋白酶降解的稳定性使其成为开发用于植物保护的有效抗菌剂的潜在候选者。
1.引言
植物病害目前是栽培和储存作物中的一个主要经济问题，因为它们会造成毁灭性损害。抗生素耐药性病原体的日益出现促使人们探索具有未被开发利用的作用模式的新型抗菌化合物。新抗生素的一个潜在来源是抗菌肽。这些化合物受到了特别关注，因为它们通过物理破坏微生物细胞膜快速杀死微生物，并且对哺乳动物细胞毒性低。抗菌肽包含多种序列和结构，分为两大类，即α-螺旋肽和β-折叠肽，但赋予它们生物活性的共同关键特征是其净正电荷和一定的两亲性。尽管其确切作用机制尚未完全清楚，但据推测，净正电荷启动与带负电的膜磷脂的相互作用，而呈现两亲性结构的能力有利于插入微生物膜。随后的膜渗透通过类似去污剂的方式破坏细菌细胞膜或形成瞬时通道或孔而发生。由于对这些肽抗生素产生耐药性需要显著改变微生物膜的脂质组成，而这不容易发生，因此不太可能产生耐药性。
具有β-折叠结构的阳离子抗菌肽通过二硫键形成或骨架环化形成。骨架环化是一种在肽上引入构象限制的方法，通常通过限制蛋白酶的可及性来提高其代谢稳定性。此外，肽环化已被证明可以促进对细菌相对于哺乳动物细胞的选择性，导致溶血活性降低。实际上，环化产生了合适的双亲性，以增强与带负电荷的细菌膜的初始结合中的静电相互作用，从而减少与红细胞电中性脂质的相互作用。此外，先导环肽两亲性性质的改变已提供了具有改进生物学特性的类似物。这种方法的一个通用例子是基于短杆菌肽S从头设计环状抗菌肽。因此，具有最佳疏水和亲水特性平衡的环肽可被认为是药物发现的良好候选者。
保持天然抗菌肽关键特征的抗菌肽的从头设计已导致具有显著活性的化合物的开发。例如，已描述了仅由赖氨酸和亮氨酸残基组成的合成两亲性肽，显示出有趣的抗菌活性。芳香族氨基酸也已包含在合成肽中。这些残基在几种天然肽的活性中起着重要作用，据报道其抗菌活性由至少包含两个带电荷残基和最少一个芳香族氨基酸的小结构域发挥。基于掺入D-氨基酸对天然肽的进一步修饰可能影响结构以及抗菌和细胞毒性特性。
我们的团队正积极致力于寻找针对具有重要经济价值的植物病原细菌的新控制方法，例如解淀粉欧文氏菌、丁香假单胞菌和辣椒斑点病菌，现有方法对其效果不够充分。特别是，我们的大量研究集中在针对这些植物病原体表现出生物活性的小环肽的从头设计。已报道了大量具有有趣抗菌活性的环肽，但针对植物病害具有抗菌活性的例子很少。从商业角度来看，小抗菌肽很有趣，可以克服与大肽相关的高生产成本，是解决农业中细菌性疾病引起的挑战性问题的良好替代方案。
在本文中，我们报告了一系列针对植物病原菌辣椒斑点病菌、丁香假单胞菌和解淀粉欧文氏菌测试的从头设计的头尾两亲性阳离子环肽。这些环肽由交替的阳离子和疏水性氨基酸组成。引入谷氨酸残基以促进固相环化步骤。它们的一般公式是c，其中X是Lys或Leu，Y是L-Phe或D-Phe，m=n=1，或m=3且n=0-5。评估了它们的最小抑菌浓度，并通过测量溶血活性确定了它们的细胞毒性作用。为了研究环化的影响，评估了母体线性肽的抗菌和溶血活性以及杀菌效果和蛋白水解敏感性。我们还研究了D-和L-非对映异构体在两亲性、活性、稳定性和二级结构方面的差异。
2.材料与方法
2.1.材料
肽合成中使用的所有9-芴甲氧羰酰基氨基酸衍生物、试剂和溶剂均购自Senn Chemicals International。尺寸D聚苯乙烯Rink酰胺SynPhaseTM灯、齿轮和主轴购自Mimotopes Pty Ltd.。三氟乙酸、N-甲基-2-吡咯烷酮、Pd、四氢呋喃、N,N-二乙基二硫代氨基甲酸钠、三异丙基硅烷和CHCl3购自Sigma-Aldrich Corporation。哌啶、N-甲基吗啉和N,N-二异丙基乙胺购自Fluka。乙酸购自Panreac。反相高效液相色谱溶剂购自J.T.Baker。
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