表型鉴定。观察在NYG平板上培养24小时的细菌菌落形态。在丰富NYG培养基和有氧条件下的细菌生长通过自动化微生物生长曲线分析仪Bioscreen C（Oy Growth Curves Ab Ltd.，美国）测量。对于细菌游动性测定，将菌株用牙签接种到含有0.1%NYG的半固体琼脂中，在28°C培养12小时，并测量游动区直径。对于生物膜定量，使用先前报道的结晶紫染色方法。将嗜麦芽寡养单胞菌培养物定量接种到96孔聚苯乙烯板内的NYG培养基中，并将板在28°C静置培养5小时。同时，通过酶标仪（Tecan Infinite 200 Pro）在600 nm波长下的吸光度（OD600）测量96孔板中的细菌生长。在染色前用水洗涤板中的孔，然后用结晶紫（1%）染色20分钟，之后再洗涤。接着，将结晶紫染色剂溶解在无水乙醇中，并在酶标仪上于590 nm波长下测量生物膜量（n=8）。
RT-PCR和实时定量PCR分析。使用TRIzol（Invitrogen，美国）提取细菌总RNA，并使用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher，美国）进行定量。接着，使用DNA-free DNase（Life Technologies）纯化提取的RNA以去除任何污染的DNA。使用随机引物（Promega，美国）和Superscript III逆转录酶（RT）（Invitrogen，美国）从纯化的RNA合成cDNA。将嗜麦芽寡养单胞菌DNA模板作为PCR的阳性对照，转移信使RNA（tmRNA）扩增作为RT-PCR的上样对照；在cDNA合成过程中缺少逆转录酶的样品作为阴性对照，以评估潜在的DNA污染。用于扩增样品基因的引物列于表2。
蛋白质表达、纯化和磷酸化分析。分别使用pET28a和pET30a（Novagen）表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达重组BfmA-His6和BfmK-His6蛋白。用于构建重组载体的PCR引物列于表2。根据制造商手册（Novagen），通过Ni-次氮基三乙酸（NTA）亲和层析纯化BfmA-His6。根据我们先前研究中使用的方法制备BfmK HK的反向膜囊泡。纯化的蛋白质和反向膜囊泡储存在储存缓冲液（50 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，50 mM NaCl，5%甘油；pH 8.0）中。
我们根据先前使用的方法进行体外磷酸化分析。简而言之，对于自磷酸化分析，将BfmK反向膜囊泡在20微升体积的自磷酸化缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH 7.8]，2 mM二硫苏糖醇[DTT]，25 mM NaCl，25 mM KCl，5 mM MgCl₂）中与含有10微居里[γ-³²P]ATP（PerkinElmer）的100微摩尔ATP在28°C孵育10分钟。为了检测BfmK和BfmA之间的磷酸转移，将20微摩尔纯化的可溶性BfmA加入反应混合物中，然后在28°C孵育图4所示的时间。通过加入6×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液终止反应。然后将磷酸化蛋白质在12%SDS-PAGE凝胶上进行分离。电泳后，将凝胶暴露于磷屏1小时，并通过PhosphorImager系统（Amersham Biosciences）记录凝胶的放射性信号。
ChIP（染色质免疫沉淀）。用于染色质免疫沉淀（ChIP）的方案遵循先前的一项研究。简而言之，将嗜麦芽寡养单胞菌在NYG培养基中培养至OD600为0.4。用1%甲醛对细胞进行交联，随后用0.5 M甘氨酸淬灭5分钟。通过离心收集的细菌培养物（4毫升）在10毫升冷的TBS缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH 7.5]，150 mM NaCl）中洗涤两次，然后重悬于1毫升裂解缓冲液（10 mM Tris[pH 8.0]，20%蔗糖，50 mM NaCl，10 mM EDTA，10毫克/毫升溶菌酶）中。将IP缓冲液（50 mM HEPES-KOH[pH 7.5]，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1%Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，1 mM苯甲基磺酰氟）加入细菌细胞悬浮液中，并使用Diagenode Bioruptor UCD-300超声仪（Diagenode，美国）对细胞进行超声处理，以产生平均约200 bp的DNA片段。离心后，用20微升蛋白A在4°C慢速旋转器上预清除溶液10分钟，并保留100微升等分试样作为上样对照DNA（输入样本）。对于ChIP分析，将20微升蛋白A-琼脂糖珠（50%浆液）和2微升抗His6抗体加入800微升等分试样中，并在4°C慢速旋转下孵育过夜。第二天，通过离心收集珠子，并用IP缓冲液和洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl[pH 8.0]，250 mM LiCl，1 mM EDTA，0.5%Nonidet P-40[相当于Triton X-114]，0.5%脱氧胆酸钠）洗涤。通过加入100微升洗脱缓冲液（50 mM Tris[pH 7.5]，10 mM EDTA，1%SDS）从珠子上洗脱免疫沉淀的染色质，并将溶液在65°C孵育10分钟。加入RNase A以去除RNA污染。使用蛋白酶K进行交联逆转。使用PCR纯化试剂盒（Qiagen，美国）纯化DNA。对于半定量PCR，使用1微升洗脱的DNA和1微升对照DNA作为模板，用适当的引物进行PCR。捕获的DNA量相对于对照输入DNA进行标准化。
EMSA（电泳迁移率变动分析）。对于电泳迁移率变动分析（EMSA），使用表2所示的引物通过PCR扩增bfmA和acoT操纵子的启动子区域。使用T4多核苷酸激酶（New England Biolabs[NEB]，美国）用[γ-³²P]ATP对PCR产物进行末端标记。将BfmA蛋白（1微克）和探针（4 fmol）在反应缓冲液[10 mM Tris(pH 7.0)，50 mM KCl，1 mM DTT(pH 7.5)，2.5%甘油，5微升MgCl₂，50纳克/微升poly(dI-dC)，0.05%NP-40，和10 mM EDTA]中孵育20分钟。加入DNA上样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）终止反应，样品通过8%非变性PAGE进行分离。使用磷屏检测放射性信号。使用不同浓度的未标记DNA探针作为竞争者。
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