方法
昆虫
本文使用的昆虫是来自长红猎蝽群体的成年交配雌性，在28°C和75%相对湿度下维持，并以新西兰白兔血为食。
寄生虫
克氏锥虫上鞭毛体（Dm28c克隆和CL Brener）在含有10%热灭活胎牛血清的肝脏浸出液胰蛋白胨（LIT）培养基中于28°C培养。表达荧光素酶和GFP的寄生虫在含有200和300μg/ml遗传霉素的LIT中生长。上鞭毛体形式在指数生长期获得。来自细胞培养的锥鞭毛体（Dm28c克隆）形式是使用循环后期锥鞭毛体寄生虫感染LLCMK2宿主细胞获得的。
表达GFP和荧光素酶的克氏锥虫品系的产生
pTEX-GFP：来自质粒pEGFP-C3（Clontech Laboratories Inc.,Mountain View,CA,USA）的718 bp片段（对应于GFP编码区）使用以下寡核苷酸（For:5'-GGGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-GAGCTGTT-3'和Rev:5'-GGGGGATCCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCAGAGT-GATC-3'）通过PCR扩增，并克隆到pTEX附加体表达载体的BamHI位点。PCR反应使用PCR热循环仪（型号9700，Applied Biosystems）进行30个循环，条件如下（94°C，1分钟；55°C，30秒和72°C，1分钟）。将所得的超螺旋质粒（100μg）通过电穿孔转染到对数生长期的克氏锥虫上鞭毛体（Dm28c）中，使用基因脉冲II电穿孔系统（Bio-Rad），如前所述。转基因寄生虫在含有遗传霉素（150μg/ml）的完全LIT培养基中进行选择并维持。
pBS:THT-Luc-T：编码萤火虫荧光素酶的整合载体（由David Engman,Northwestern University,Chicago慷慨赠送）用于实现荧光素酶基因在锥虫微管蛋白基因座的稳定整合。将10微克Sall线性化质粒转染到对数生长期的克氏锥虫上鞭毛体（Dm28c）中，使用Human T cell nucleofector试剂盒在Amaxa转染装置中（设置为程序TX-011）。选择对潮霉素具有抗性的寄生虫（24小时后为50 ug/ml，在药物选择期间增加至200 ug/ml），并通过体外连续稀释寄生虫评估荧光素酶活性。
pTREX-luc Dm28c菌株（上鞭毛体和锥鞭毛体形式）（由Cristina Henriques和Wanderley de Souza,UFRJ慷慨赠送）在200μg/ml遗传霉素存在下生长。pTREX-luc是一种靶向核糖体基因座的整合载体。来自细胞培养的锥鞭毛体形式是使用循环后期锥鞭毛体寄生虫感染LLCMK2宿主细胞获得的。
肠道微生物群培养
罗氏红球菌（Rhodococcus rhodnii）是我们长红猎蝽群体中唯一可培养的定植于昆虫肠道的细菌，从饥饿昆虫的AM中分离，并在28°C、120 rpm摇床条件下在Luria-Bertani（LB）肉汤中培养。使用Bioscreen C微生物生长曲线分析仪（Labsystems Oy,Helsinki,Finland）在600 nm处测量OD来估计细菌浓度。将细菌培养至对数期，离心收集，用于后续昆虫喂养。为了建立无菌一龄若虫，收集卵并用次氯酸钠（1%）洗涤40秒，然后用无菌PBS洗涤三次。将卵置于无菌小瓶中孵化，并在28°C下维持。
感染
实验昆虫通过乳胶人工膜喂养装置，喂食含有肝素化（2.5单位/毫升）和热灭活（56°C加热45分钟）兔血，其中含有10^7 x ml^-1或10^6 x ml^-1表达GFP或荧光素酶的寄生虫（上鞭毛体或锥鞭毛体）。对于感染，成虫饥饿28天，一龄若虫在孵化后5-7天使用。在指示的情况下，成虫和若虫分别用克氏锥虫加10^7-10^8/ml罗氏红球菌或10^6/ml罗氏红球菌感染。在一组特定的实验中，成虫喂食含有1x10^7热灭活（65°C，2小时）寄生虫/毫升的血液。仅使用完全饱食的昆虫进行实验。感染后，如上所述维持昆虫。
落射荧光显微镜
喂食含有10^7 GFP表达上鞭毛体/毫升血液的昆虫在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2）中解剖，安装在载玻片和盖玻片之间，无需固定进行观察。或者，用镊子打开AM，安装在载玻片和盖玻片之间，以便更好地分析顶端区域的消化细胞。使用配备100 W汞灯、通过Zeiss-10滤光片组（激发-BP 450-490；分束器-FT 510；发射-BP 515-565）过滤的Zeiss Axioobserver Z1显微镜进行微分干涉相差（DIC）和荧光显微镜检查。使用单色Axiocam MRC5采集图像。在指示的情况下，使用配备100 W汞灯、通过Zeiss-09滤光片组（激发BP 450-490；分束器FT 510；发射LP 515）过滤的Zeiss Axioplan 2荧光显微镜进行彩色荧光图像采集，并通过10-24 mm Fujicolor Superia X-Tra胶片400 ASA曝光获取。所有获得的图像均使用Adobe PhotoShop进行等效处理。
生物发光成像
使用生物发光成像系统（IVIS-Lumina;Caliper,Hopkinton,MA）监测感染表达荧光素酶的寄生虫的昆虫或其解剖的肠道，并在整个实验期间采集图像。使用Living Image 3.2软件分析图像。成像时间为5分钟。在成像前，使用汉密尔顿注射器将3μl荧光素底物（VivoGlo luciferin in vivo grade(Promega),15 mg/ml）注射到成虫的血腔中。使用纳米注射器（Nanoject,Drummond）和玻璃毛细管针将138 nl相同溶液注射到一龄若虫体内。体内实验：注射后十五分钟，在背位对昆虫进行成像。体外实验：注射后十五分钟，解剖昆虫，对肠道进行成像。
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