摘要
目的对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kpn)Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system，T6SS)结构基因vgrG进行敲除，评估缺失vgrG后的细菌体外生长能力和致病力。
方法根据NCBI公布的Kpn vgrG序列和前后基因序列设计引物，经PCR扩增出vgrG上下游同源臂序列并搭桥后克隆至载体pKO3-Km，重组载体导入Kpn感受态细胞，经同源重组获得vgrG缺失株ΔvgrG。通过PCR扩增出vgrG启动子加完整基因片段并克隆至载体pBAD33，导入缺失株ΔvgrG感受态细胞获得回补株CΔvgrG。将野生株WT、ΔvgrG株和CΔvgrG株在LB(Luria-Bertani)液体培养基中培养并比较生长速度；不同菌株感染人肺上皮细胞A549比较黏附细胞能力；不同菌株感染小鼠巨噬细胞Raw264.7比较胞内存活能力；不同菌株感染小鼠观察小鼠的存活率(n＝10)和肺脏细菌数量(n＝6)。组间比较采用t检验。
结果经过同源重组获得了ΔvgrG株，经特异性引物鉴定相比WT株缺失了完整vgrG片段(2 487 bp)，并在此基础上获得了CΔvgrG株。Kpn缺失vgrG前后细菌的体外生长能力没有显著变化[(1.40±0.10)vs(1.20±0.30)，t＝0.63，P>0.05]，WT株黏度显著高于ΔvgrG株[(0.96±0.04)vs(0.38±0.05)，t＝9.72，P<0.05]，CΔvgrG株黏度也显著高于ΔvgrG株(P<0.05)。细胞层面，野生株WT对A549细胞的黏附菌量显著多于ΔvgrG株[(5 367.00±318.00)CFU vs(4 067.00±88.19)CFU，t＝3.94，P<0.05]，CΔvgrG株黏附菌量也显著高于ΔvgrG株(P<0.05)。细菌感染12 h后，WT株在巨噬细胞中的存活率显著高于ΔvgrG株[(69.00±1.00)%vs(47.50±2.50)%，t＝7.99，P<0.05]。动物层面，致死剂量感染小鼠后WT株组存活率显著低于ΔvgrG株组[(16.67±8.82)%vs(53.33±6.67)%，t＝3.32，P<0.05]；半致死剂量感染小鼠后WT株组小鼠肺脏细菌数显著多于ΔvgrG组[(4.97±0.06)lg CFU/g vs(4.05±0.04)lg CFU/g，t＝12.27，P<0.01]，CΔvgrG株组小鼠肺脏细菌数也显著多于ΔvgrG株组(P<0.01)。
结论vgrG不影响Kpn的体外生长，但参与Kpn对上皮细胞的黏附、抵抗巨噬细胞杀伤和对小鼠的致病力。
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kpn)是一种机会性病原体，可引起多种院内感染和社区获得性感染，因其菌株的强特异性、广泛的耐药性和丰富的毒力因子库，目前已成为公共卫生的重大威胁。
细菌分泌系统是存在于细菌表面的结构，可使细菌与周围环境交换信息以获取营养物质并运输效应蛋白。因此，分泌系统可以调节细菌与宿主之间的相互作用。目前，革兰阴性菌中已发现9种不同的分泌系统，从Ⅰ型(typeⅠsecretion system，T1SS)到Ⅸ型(T9SS)。Ⅵ型分泌系统(T6SS)于2006年在霍乱弧菌中首次发现，T6SS是一种跨膜复合物，用于将效应物递送至宿主或靶细菌。其作用过程类似于噬菌体尾部收缩的穿刺机制，将装有效应物的针头注入靶细胞，该系统的两种重要蛋白质：溶血素共调节蛋白(hemolysin co-regulated protein，Hcp)和缬氨酸-甘氨酸重复G蛋白(valine-glycine repeat G，VgrG)是可以由胞内转运到胞外的易位蛋白。
最近研究表明，T6SS可能在Kpn的毒力中发挥重要作用。而VgrG装置蛋白对Kpn致病性的直接影响研究较少，本研究拟通过同源重组方法构建Kpn vgrG缺失株并进行体内外生物学功能评价，探究vgrG对细菌致病性的影响，这将为理解Kpn T6SS与致病力的关系并发掘Kpn新的防治靶点提供基础资料。
材料和方法
1．生物材料：
高毒力K2血清型Kpn由苏北人民医院整形烧伤外科前期临床分离并保存；大肠埃希菌DH5α及质粒pKO3-Km、pBAD33由本科室保存；人肺上皮细胞A549和小鼠巨噬细胞Raw264.7由本科室保存；6周龄BALB/c雌性小鼠购于扬州大学比较医学中心，动物许可证号：SCXK(苏)2022-0009；严格按照扬州大学动物伦理委员会批准的国家动物实验要求进行，本研究通过扬州大学实验动物福利与伦理委员会审核批准(202407013)。
2．主要试剂：
高保真PCR酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶NotⅠ、SalⅠ和KpnⅠ(日本TaKaRa)；同源重组连接酶(上海翌圣生物)；胎牛血清、DMEM培养基(美国GIBCO)；其他的生化试剂为国产分析纯。
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