一步生长曲线
通过一步生长实验确定所选噬菌体的裂解量(平均每个感染细胞释放的噬菌体数量)和潜伏期(从感染到子代噬菌体开始释放的时间),该方法参考了的描述并略有修改。
图2噬菌体FSboM-AG3的一步生长曲线。以博氏志贺氏菌C865为宿主,培养温度为30℃。
透射电子显微镜
用于电子显微镜观察的噬菌体样品制备如下:使用 Beckman J2-21(Palo Alto, Ca)离心机和 JA-18.1 固定角转子,将噬菌体在 0.1 M 中性乙酸铵溶液中以 25,000 g 离心 60 分钟进行沉淀。随后,在相同条件下用 0.1 M 中性乙酸铵溶液洗涤两次。纯化的噬菌体样品沉积在铜网上的碳涂层 Formvar 薄膜上,用 2% 磷钨酸钾(pH 7.0)进行负染,并在操作电压为 60 kV 的 Philips EM 300 电子显微镜下进行观察。使用 T4 噬菌体的尾部作为标尺来监控放大倍数。
DNA 分离和测序
粗噬菌体裂解液通过 4°C 下 14,000 x g 离心 20 分钟去除细菌碎片。上清液中的污染核酸使用胰 DNase I 和 RNase A(终浓度均为 10μg/mL,Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON)进行消化,然后加入 10% (w/v, 终浓度) PEG-8000 和 1 M NaCl,于 4°C 沉淀噬菌体颗粒过夜。沉淀的噬菌体颗粒通过离心回收,重悬于 TM 缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM MgSO4)中,并通过在自生氯化铯(CsCl)梯度(CsCl 密度 1.5 g/ml,使用 Beckman SW 90Ti 固定角转子,4°C 下 21,000 x g 离心 24 小时)上进行分离来纯化。经过第二次 CsCl 梯度离心(再离心 24 小时)纯化后,使用分子量截留值为 3500 的 Pierce 透析盒(Thermo Scientific, Fisher Scientific, Mississauga, ON),将噬菌体对 1x 10 mM TE 缓冲液(pH 8.0)透析两次(每次两升),并于 4°C 储存。从部分纯化的病毒颗粒中提取 DNA,采用基于的 SDS/蛋白酶 K 方法进行修改,随后用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1, V/V)抽提,乙醇沉淀,并溶解于 10 mM Tris-HCl(pH 7.5)中。通过分光光度法对 DNA 进行表征。
该 DNA 在麦吉尔大学和基因组魁北克创新中心(蒙特利尔,QC,加拿大)进行了覆盖度为 19x 的焦磷酸测序(454 技术)。
基因组注释
在注释之前,将基因组在 rIIA 基因的上游立即打开,以便与相关的 ViI 噬菌体序列进行比较。基因组首先使用 AutoFACT进行自动注释,随后使用 Kodon version 2.0 (Applied Maths Inc., Austin, TX, USA) 确认所有开放阅读框(ORFs)。从预测的编码序列中鉴定基因的依据是:存在 ATG、GTG、CTG 或 TTG 起始密码子,后跟至少 30 个额外密码子,以及上游序列与核糖体结合位点 GGAGGT 相似。使用默认参数,通过 tRNAScan-SE 和 Aragorn 鉴定噬菌体编码的 tRNA 基因。
在 http://pfam.sanger.ac.uk/search#searchBatchBlock 进行了批量 PFAM 基序搜索,而使用 http://greengene.uml.edu/programs/FindMW.html 确定蛋白质分子量和等电点。
使用 BLASTP 算法确定与美国国家生物技术信息中心[NCBI]数据库中已描述蛋白质的相似性,搜索使用 Batch BLAST (http://greengene.uml.edu/programs/NCBI_Blast.html) 进行。使用 DNAMAN 确定噬菌体 SboM-AG3 及其宿主鲍氏志贺氏菌的密码子使用信息。启动子的鉴定基于与共识大肠杆菌启动子 TTGACA(N15-18)TATAAT 的序列相似性,该序列位于注释基因的上游。通过使用 MFOLD检查与 polyT 序列相邻的 DNA 二级结构来发现 ρ-非依赖性终止子。此外,我们还使用了 http://pallab.serc.iisc.ernet.in/gester/rungester.html 的 WebGeSTer。仅报告 ΔG 小于 -10 kcal/mol 的终止子。使用 CoreGenes在蛋白质组水平进行基因组比较。使用 TMHMM v2.0 和 Phobius预测跨膜结构域。
蛋白质组分析
使用 Laemmli 样品缓冲液(4% SDS, 20% 甘油, 10% 2-巯基乙醇, 0.004% 溴酚蓝, 0.125 M Tris HCl)裂解完整的噬菌体颗粒,并煮沸 5 分钟。随后,溶解的蛋白质通过 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,并使用 SimplyBlue SafeStain(Invitrogen Canada, Burlington, ON)染色。使用 BioNumerics 软件(Applied Maths)分析凝胶数据。六个最强烈的噬菌体条带被切下,并在女王大学(安大略省金斯顿,加拿大)的质谱设施中进行质谱分析。
基因组序列
志贺氏菌噬菌体 SboM-AG3 的注释基因组序列已存入 NCBI 核苷酸数据库,登录号为 FJ373894。
