6.L01-B1可能改变人类肠道微生物群的组成
由于多糖是塑造肠道微生物群组成的关键因素，我们随后研究了L01-B1对人类肠道微生物群进行了16S rRNA基因多样性测序。
对于α多样性，在ASV水平上，对照组和L01-B1组的Ace和Chao指数均无显著差异（p>0.05）（图5b和c）。对于β多样性，在ASV水平上，主坐标分析（PCoA）和非度量多维标度（NMDS）显示两组间无显著差异（图5d–f）。我们进行了中性群落模型（NCM）分析，结果表明，补充L01-B1后群落结构发生了显著变化（图5g）。韦恩图分析显示，与对照组相比，L01-B1组的物种数量减少（图5h）。
在门水平上，肠道微生物群的组成发生变化，与对照组相比，变形菌门和拟杆菌门的丰度降低，而放线菌门的丰度增加（图5i）。基于前50个物种的丰度，热图分析显示，与对照组相比，费氏大肠杆菌（Escherichia fergusonii）的丰度显著降低（图5j）。有趣的是，补充L01-B1后，长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）的丰度增加（图5j）。在物种水平上，我们进一步对两组进行了比较分析和LEfSe分析，结果表明，费氏大肠杆菌在对照组中富集，而长双歧杆菌在L01-B1组中富集（图5k和l）。综合来看，L01-B1可能改变人类肠道微生物群的组成，并可能增加长双歧杆菌的丰度。
图5.基于16S rRNA基因的多样性测序显示，L01-B1可改变人类肠道微生物群的组成。（a）体外实验的示意图。（b）ASV水平上的α多样性分析，Ace指数。（c）ASV水平上的α多样性分析，Chao指数。箱线图显示了最小值、最大值、中心、箱体边界、须状线以及百分位数。（d）ASV水平上的主坐标分析（PCoA）。（e）ASV水平上的非度量多维标度（NMDS）分析。（f）ASV水平上的NMDS分析。（g）中性群落模型（NCM）分析。（h）物种水平上的韦恩图分析。（i）柱状图显示的门水平上肠道微生物群的组成分析。（j）热图显示的物种水平上肠道微生物群的组成分析。（k）对照组和L01-B1组在物种水平上的比较。（l）物种水平上的LEfSe分析。
7.L01-B1在体外富集长双歧杆菌
为了验证长双歧杆菌的丰度，根据热图结果从每组中选取了四个样本进行宏基因组测序（图5j）。在物种水平上，α多样性和β多样性分析的结果均存在显著差异（p<0.05）（图S10a–d）。这些发现表明，L01-B1改变了肠道微生物群的结构。通过门水平的柱状图显示，肠道微生物群的组成发生了显著变化。分析结果显示，拟杆菌门的丰度大幅下降，而放线菌门的丰度显著增加（图6a）。在物种水平上，热图结果表明，长双歧杆菌的丰度显著增加（图6b，c）。
我们随后对两组进行了比较分析和LEfSe分析。与多样性测序的结果一致，长双歧杆菌显著富集（图6d，e）。综上所述，我们得出结论，L01-B1显著增加了长双歧杆菌的丰度，而对拟杆菌属细菌则可能不那么友好。
图6.宏基因组测序显示，L01-B1增加了长双歧杆菌的丰度。（a）在门水平上分析了人类肠道微生物群的组成。（b）在物种水平上分析了人类肠道微生物群的组成。（c）分析了长双歧杆菌的相对丰度。（d）两组在物种水平上的比较。（e）物种水平上的LEfSe分析。数据代表技术重复三次（n=4）。对于两组之间的比较，采用非配对双尾学生t检验。
8.从人粪便中分离出长双歧杆菌亚种sueorum
为了进一步探讨这一现象，我们尝试从人粪便中分离出长双歧杆菌。正如预期，菌落在37°C无氧培养箱中培养48小时后在mMRS平板上生长良好（图7a）。16S rRNA测序及比对结果显示，分离出的菌株为长双歧杆菌亚种sueorum，并命名为DK001（图S11）。生化鉴定表明，DK001能够发酵棉子糖、乳糖、D-核糖和淀粉，但不能发酵葡萄糖酸、三梨醇、纤维二糖、山梨醇或D-阿拉伯糖（表S6）。透射电子显微镜（TEM）结果显示，该菌株无荚膜，呈卵圆形（图7b）。系统发育树分析显示，DK001与从中国分离的长双歧杆菌亚种sueorum具有较高的同源性（图7c）。因此，本研究成功分离并鉴定了长双歧杆菌的一个亚种。
图7.细菌分离与鉴定。（a）使用添加50 mg/L莫匹罗星的mMRS平板进行细菌分离。（b）通过透射电子显微镜（TEM）观察DK001的形态特征。（c）利用MEGA 11.0软件对DK001菌株进行系统发育树分析。
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