摘要
在革兰氏阴性菌中，多药外排泵负责排出对生长有害的化学物质。部分外排泵由内源性效应物诱导，另一些则受非生物或生物信号调控表达。在恶臭假单胞菌中，TtgABC外排泵是主要的抗生素排出系统，通过TtgR介导的操纵子表达调控响应外源性抗生素。质粒编码的TtgGHI外排泵在亲本菌株的抗生素耐药性中作用较弱，但在TtgABC缺陷的同基因背景中至关重要。ttgGHI的表达受TtgV调节子抑制，该调节子可将吲哚识别为效应物，而恶臭假单胞菌自身不产生吲哚。由于假单胞菌不合成吲哚，这种吲哚依赖性抗生素耐药性似乎是微生物群落水平耐药机制的一部分。恶臭假单胞菌能够识别培养基中添加的吲哚或混合微生物群落中大肠杆菌产生的吲哚。转录组分析显示，吲哚特异性响应涉及43个基因的激活和23个基因的抑制。吲哚不仅增强TtgGHI泵的表达，还上调与铁稳态相关的基因以及氨基酸分解代谢基因。在TtgABC缺陷的恶臭假单胞菌中，氨苄西林等杀菌化合物会导致细胞死亡；而大肠杆菌与恶臭假单胞菌ΔttgABC共培养时，吲哚依赖性外排泵的诱导可使该突变体在氨苄西林存在下存活。
引言
恶臭假单胞菌是一类广泛存在的微生物，可在植物根际土壤中以及水生系统中以悬浮态或生物膜形式附着于生物和非生物表面。该物种在多种环境条件下的存活和增殖，依赖于其丰富的代谢活性以及对其他微生物产生的抗菌化合物的响应能力。
恶臭假单胞菌DOT-T1E菌株分离自格拉纳达污水处理厂，能够在高浓度芳香族化合物等有机溶剂存在下生长。此后研究表明，该菌株对多种有毒化合物具有耐药性，包括染料、重金属以及多种杀菌抗生素（如氨苄西林、哌拉西林、诺氟沙星）和抑菌抗生素（如氯霉素、四环素、红霉素）。该微生物对杀菌和抑菌抗生素的主要耐药机制，是通过耐药性-结节形成-细胞分裂（RND）家族的多种多药外排泵将抗生素排出细胞。已在恶臭假单胞菌DOT-T1E的基因组中鉴定出19个RND外排泵，其中两个已通过实验证实参与抗生素排出：其一为TtgABC（T1E_0241-0243），位于染色体上，被认为是该菌株中与抗生素耐药性最相关的外排泵；另一个是质粒编码的TtgGHI，其在有机溶剂排出中更为重要。
TtgABC泵的表达具有基础水平，且受TetR家族的TtgR调节子调控，可响应特定抗生素和黄酮类化合物。TtgGHI外排泵的表达受IclR家族的抑制子TtgV调控，该抑制子不将抗生素识别为效应物，而是识别吲哚——一种假单胞菌不合成的分子，且已被证实是TtgV的高效效应物。
吲哚被认为是一种细胞内和细胞间信号分子。我们推测这两种外排泵在抗生素耐药性中发挥不同作用：TtgABC属于单细胞水平的自身耐药机制，而吲哚诱导的TtgGHI则属于群落水平的耐药机制。在肠杆菌中，色氨酸通过色氨酸酶作用产生吲哚，该过程不被细胞代谢，而是分泌到胞外培养基中，浓度可达0.5 mM。胞外吲哚可被大肠杆菌细胞摄取，并参与调控多种过程，如耐药性、质粒稳定性、某些致病菌的毒力特征以及生物膜形成，因此吲哚可作为种内信号分子。此外，吲哚也可被非肠杆菌摄取，并影响多种表型，例如抑制黑曲霉生长、增强肠炎沙门氏菌的耐药性、促进铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和乌纳马伯克霍尔德菌的生物膜形成，还可减弱铜绿假单胞菌的毒力，因此吲哚也是一种种间信号分子。
本研究探讨了不同同基因恶臭假单胞菌菌株在有无吲哚存在时，对杀菌和抑菌抗生素的响应；以恶臭假单胞菌为模型系统，明确了吲哚作为种间信号的作用。吲哚可影响恶臭假单胞菌中至少76个基因的表达模式，这些基因涉及细胞代谢、细胞壁生物合成和应激防御，结果支持吲哚在恶臭假单胞菌中作为信号分子的功能。本研究证实，肠杆菌产生的吲哚可通过诱导TtgGHI外排泵并促进抗生素排出，使假单胞菌在药物存在下存活。
实验方法
菌株与培养条件
细菌细胞在液体LB培养基中培养，恶臭假单胞菌培养温度为30°C，大肠杆菌为37°C，在摇床中以200转/分钟振荡培养。必要时添加适当抗生素，终浓度如下：卡那霉素50μg/mL、利福平20μg/mL；本研究中使用的其他抗生素浓度见正文。
氨苄西林存在下大肠杆菌与恶臭假单胞菌的共培养实验
在该系列实验中，将不同细胞接种到20 mL LB培养基中，在无抗生素条件下单独培养12-14小时；用无菌LB肉汤将这些培养物的浊度调整至660 nm处吸光度为0.1（约1±0.1×10^5 CFU/mL），然后将10 mL大肠杆菌细胞与10 mL恶臭假单胞菌DOT-T1E或恶臭假单胞菌T1E-18混合；以各菌株单独培养作为对照。如正文所述，向所有培养物中添加氨苄西林（300μg/mL），随后在30°C振荡培养20小时。实验结束时取样，系列稀释后涂布到选择性培养基上：添加20μg/mL利福平的固体LB培养基用于计数恶臭假单胞菌DOT-T1E；添加利福平和卡那霉素的固体LB培养基用于计数T1E-18；添加50μg/mL链霉素和100μg/mL氨苄西林的固体LB培养基用于计数大肠杆菌K111。在30°C培养24小时后计数菌落，推算CFU/mL；每个实验至少重复三次。
最低抑菌浓度（MIC）测定
根据临床和实验室标准协会的指南，采用两倍系列稀释法在含或不含300μM吲哚的液体LB培养基中进行MIC测定。使用的抗生素最高浓度如下：四环素10,000μg/mL、氯霉素3000μg/mL、诺氟沙星200μg/mL、红霉素3000μg/mL和氨苄西林10,000μg/mL。每个测定至少进行三次独立实验，每个实验设置三个重复；MIC定义为抑制菌株生长的最低抗生素浓度。
纸片扩散法抗生素敏感性测试
采用柯比-鲍尔法：在含或不含300μM吲哚的LB琼脂平板上，涂布约10^8 CFU/mL的野生型恶臭假单胞菌DOT-T1E或其突变体菌株（恶臭假单胞菌T1E-18、T1E-PS28和T1E-PS32），形成菌苔；平板表面干燥后，将氧氟沙星（5μg）、培氟沙星（5μg）、阿莫西林（25μg）、替卡西林（75μg）、氨苄西林（10μg）、头孢他啶（30μg）、氯霉素（30μg）、红霉素（15μg）和四环素（30μg）的抗生素纸片放置在平板表面；在30°C培养18-20小时后，测量每个纸片周围的抑菌圈直径（mm）。在以大肠杆菌上清液作为吲哚来源的系列实验中，将100 mL过滤后的培养上清液与50 mL 5%LB琼脂混合并铺板，实验方法与添加纯吲哚时相同。
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