3.2.抗生素对生物膜的影响
两性霉素B是用于真菌感染的标准抗生素，但其肾毒性是该治疗最严重的问题。此外，其通过膜的渗透性差是增加患者给药剂量的原因，这有助于真菌耐药性的发展。像先前研究一样，我们的结果（图3）证实两性霉素B促进预形成生物膜的进一步生长而不是根除它，但能够抑制微生物粘附约60%与对照相比，在浓度3μg ml⁻¹下，这是近平滑念珠菌悬浮细胞MIC的两倍。另一方面，两性霉素B能够减少克鲁斯念珠菌固着细胞预形成生物膜的定植区域，即使在浓度5μg ml⁻¹下（其悬浮细胞MIC的两倍）。其抑制微生物粘附的效果在最高测试浓度（20μg ml⁻¹）下仅为35%。两性霉素B对任一研究微生物的生物膜发展无显著影响，且不影响生物膜排列（图像未显示）。
3.3.天然物质对生物膜的影响
虽然黄芩素对念珠菌属悬浮细胞的抗真菌活性以及对白念珠菌的抗生物膜活性先前已被报道，并且黄芩素对近平滑念珠菌悬浮细胞的影响已被研究，但关于黄芩素对近平滑念珠菌和克鲁斯念珠菌抗生物膜活性的数据仍然不足。
为了提供黄芩素抗生物膜活性的更详细评估，图4显示黄芩素对三个不同阶段生物膜形成的影响。发现黄芩素对每种研究念珠菌菌株的效率不同。在近平滑念珠菌中观察到预形成生物膜生物量的更高减少，不影响生物膜排列。在近平滑念珠菌中即使在20μg ml⁻¹下观察到约60%预形成生物膜抑制，在克鲁斯念珠菌中在50μg ml⁻¹下（单因素方差分析，P≤0.001）。在近平滑念珠菌中观察到黄芩素对生物膜排列和簇形成的影响（图4中白圈高亮簇）。黄芩素抑制近平滑念珠菌生物膜发展（单因素方差分析，P=0.005），但未确认对克鲁斯念珠菌的显著影响（单因素方差分析，P=0.074）。在浓度低于MIC——近平滑念珠菌50μg ml⁻¹和克鲁斯念珠菌细胞60μg ml⁻¹下观察到超过30%微生物粘附抑制，结果显著性通过单因素方差分析对两种微生物确认（P<0.001）。黄芩素在所有研究实验设置（粘附、生物膜发展和预形成生物膜）中诱导克鲁斯念珠菌生物膜簇形成，在近平滑念珠菌中较高浓度下。
壳聚糖的抗菌作用以及低分子量壳聚糖水凝胶的抗真菌和抗生物膜特性先前已被描述。壳聚糖似乎是微生物粘附抑制或生物膜减少的非常有效的剂。已证明壳聚糖水凝胶能够显著减少体外和体内念珠菌生物膜形成。尽管生物膜结构存在巨大差异，不仅在不同物种菌株之间，而且在同一物种菌株之间，壳聚糖活性在同一物种内通常一致和恒定。
使用新方法——通过Cellavista自动显微镜评估随后图像分析，我们确认了近平滑念珠菌和克鲁斯念珠菌的这一结果（图5）并补充了描述壳聚糖对生物膜形成影响的数据。与先前研究相反，我们的结果显示了壳聚糖对近平滑念珠菌微生物粘附抑制的显著抑制效果（单因素方差分析，P<0.001）在显著更低浓度下（在40μg ml⁻¹下粘附减少60%）特别是克鲁斯念珠菌（在20μg ml⁻¹下下降80%，通过单因素方差分析确认，P<0.001）。在物质自然影响生物膜发展的条件下，壳聚糖对近平滑念珠菌无影响；壳聚糖甚至增加克鲁斯念珠菌在此生物膜生长阶段的生物膜形成。壳聚糖对近平滑念珠菌的根除作用，仅影响预形成生物膜根除中的固着细胞，最大为30%（在40μg ml⁻¹下），而克鲁斯念珠菌预形成生物膜根除约为40%（在25μg ml⁻¹下）。壳聚糖对近平滑念珠菌和克鲁斯念珠菌生物膜根除的影响显著（单因素方差分析，P=0.015）。
Cellavista基本上是一种允许将单个图像合并为更大单元的自动显微镜。如此创建的较大区域组合随后进行图像分析。根据已发表作品，该设备通常用于组织培养监测和分析，但其特性也可有利地用于微生物生物膜研究，生物膜通常在载体上创建异质形成，单个显微镜图像不提供完全客观的视图。据我们所知，Cellavista从未用于酵母细胞粘附定量或研究通过添加抗生素和其他具有抗生物膜活性的生物活性天然物质诱导的生物膜形成不同阶段的调节效应。唯一相关研究描述了使用Cellavista通过荧光应用藻类生物膜对表面的污染。
使用Cellavista自动显微镜与图像分析软件为固着细胞的定性和定量带来了新的可能性，并同时将生物膜特征化为整体。在我们的研究中，这一特性通过探索两性霉素B、黄芩素和壳聚糖对酵母生物膜形成的抗真菌/抗生物膜活性通过明场应用记录。对于荧光应用，需要40x物镜，因此培养容器底部厚度不应厚于约150-200微米。这需要专用培养容器，理想情况下具有指定用于显微镜的玻璃底部，厚度均匀。对于高通量筛选，我们因此提出明场应用和本工作中使用的标准微孔板。我们的方法将其应用潜力扩展到微生物领域，并允许轻松监测生物膜形成和快速筛选生物活性化合物的效果。
总之，我们已显示黄芩素和壳聚糖是能够抑制微生物对表面粘附或破坏近平滑念珠菌和克鲁斯念珠菌预形成生物膜的天然物质。另一方面，通常使用的真菌抗生素两性霉素B促进近平滑念珠菌生物膜形成而不是根除它。自动显微镜Cellavista因此代表一种显著提高实验工作效率的优秀设备，提供与先前发布程序完全可比的结果，并如上所述允许更全面的生物膜视图。
虽然黄芩素在高浓度下显示抗菌活性，但其抗生物膜活性在约低十倍的浓度下观察到。这是一个相当重要的发现，因为大多数先前描述的物质通常在更高浓度下对生物膜更有效而不是对悬浮细胞的最小抑制浓度。我们相信黄芩素和壳聚糖适用于医疗设备上微生物生物膜的破坏，并且也可以预期以合适的应用形式适用于各种人类生物膜相关感染的治疗。
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