3.3 抗菌敏感性测试和β-内酰胺酶产生菌株的表型检测筛选


抗生素通常用于治疗细菌病因的感染，其近几十年的广泛使用导致了与病原菌和腐生细菌抗生素抗性相关的巨大问题。在我们的研究中，对属于八个不同类别的28种抗菌药物测试了细菌菌株的敏感性（表3）。在测试的菌株中，17株（39.5%）对任何测试抗生素均未表现出表型抗性。所有菌株对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦和替卡西林/克拉维酸（青霉素类）；头孢噻肟和头孢他啶/阿维巴坦（头孢菌素类）；所有测试碳青霉烯类（厄他培南、亚胺培南、美罗培南）；氨曲南（单环β-内酰胺类）；左氧氟沙星（氟喹诺酮类）；氯霉素（苯酚类）；和复方磺胺甲噁唑/甲氧苄啶（磺胺类）敏感。


表3. 细菌的表型耐药性

细菌菌株编号 分离来源 抗生素耐药谱 多重抗生素耐药指数 多重耐药菌
KKP 3706 芝麻菜 AMP-SAM-AMC 0.11
KKP 3655 芝麻菜 AMC-MXF 0.07
KKP 3800 芝麻菜 无耐药* -
KKP 3801 芝麻菜 无耐药* -
KKP 3825 芝麻菜 无耐药* -
KKP 3651 芝麻菜 无耐药* -
KKP 3889 混合叶沙拉配胡萝卜 AMC -
KKP 575 混合叶沙拉配胡萝卜 AMP-SAM-AMC 0.11
KKP 1384 混合叶沙拉配胡萝卜 AMP-CPT-CRO-PEF-MXF-AK 0.21 +
KKP 3082 混合叶沙拉配胡萝卜 AMP-AMC 0.07
KKP 3687 混合叶沙拉配胡萝卜 CPT-MXF 0.07
KKP 3824 混合叶沙拉配胡萝卜 无耐药* -
KKP 591 混合叶沙拉配胡萝卜 AMP-CPT 0.07
KKP 3083 混合叶沙拉配胡萝卜 AMP-CPT 0.07
KKP 590 混合叶沙拉配胡萝卜 AMP-AMC-FEP-CPT-CAZ-CT-PEF-MXF-AK 0.32
KKP 3084 混合叶沙拉配甜菜根 AMP-CPT 0.07
KKP 589 混合叶沙拉配甜菜根 无耐药* -
KKP 1383 混合叶沙拉配甜菜根 AMP-CPT-CT-CRO-CIP-PEF-MXF-NOR-AK-TOB 0.36 +
KKP 3654 混合叶沙拉配甜菜根 无耐药* -
KKP 357 混合叶沙拉配甜菜根 AMC-CPT-CT 0.11
KKP 3688 混合叶沙拉配甜菜根 无耐药* -
KKP 3705 混合叶沙拉配甜菜根 无耐药*
KKP 581 混合叶沙拉配甜菜根 AMC-MXF-AK 0.11 +
KKP 585 混合叶沙拉配甜菜根 AMP-AMC-CPT-CT-PEF-MXF-AK-CN-TOB 0.32 +
KKP 3650 混合叶沙拉配甜菜根 无耐药* -
KKP 3689 混合叶沙拉配甜菜根 AMP-NOR 0.07
KKP 584 混合叶沙拉配甜菜根 无耐药* -
KKP 3684 混合叶沙拉配甜菜根 AMP-AMC 0.07
KKP 3685 已清洗菠菜 AMP-CPT 0.07
KKP 3652 已清洗菠菜 无耐药* -
KKP 3686 已清洗菠菜 AMP-SAM-AMC 0.11
KKP 3802 已清洗菠菜 无耐药* -
KKP 3707 已清洗菠菜 无耐药* -
KKP 3691 已清洗菠菜 无耐药* -
KKP 3692 未清洗菠菜 AMP-SAM-AMC-CPT-CT-OFX 0.21 +
KKP 3887 未清洗菠菜 AMP -
KKP 3892 未清洗菠菜 AMP-SAM-AMC 0.11
KKP 3656 未清洗菠菜 AMP-SAM-AMC-CPT 0.14
KKP 3888 未清洗菠菜 无耐药* -
KKP 3891 未清洗菠菜 CPT -
KKP 3890 未清洗菠菜 无耐药*
KKP 671 未清洗菠菜 AMP-AMC-CPT-MXF-CN-TOB 0.21 +
KKP 1218 未清洗菠菜 AMP-CPT-MXF-OFX 0.14 +


*表示：对测试抗生素无耐药性；注释：AMP-氨苄西林；SAM-舒巴坦/氨苄西林；AMC-阿莫西林/克拉维酸；FEP-头孢吡肟；CPT-头孢洛林；CAZ-头孢他啶；CT-头孢洛扎/他唑巴坦；CRO-头孢曲松；CIP-环丙沙星；PEF-培氟沙星；MXF-莫西沙星；OFX-氧氟沙星；NOR-诺氟沙星；AK-阿米卡星；CN-庆大霉素；TOB-妥布霉素；缩写：MAR-多重抗生素耐药；MDR-多重耐药菌株；芝麻菜；胡萝卜混合叶沙拉；甜菜根混合叶沙拉；清洗菠菜；未清洗菠菜。


在本研究中，大多数细菌菌株显示的MAR（多重抗生素耐药）指数低于0.3，而三株菌株的MAR指数高于0.3：从甜菜根混合叶沙拉中分离的水生拉恩氏菌KKP 1383（MAR指数=0.36）、从甜菜根混合叶沙拉中分离的粘质沙雷氏菌KKP 585（MAR指数=0.32）和从胡萝卜混合叶沙拉中分离的成团泛菌KKP 590（MAR指数=0.32）。此外，菌株中MAR的患病率较低；18.6%（8/43）的分离株为MDR（多重耐药）。水生拉恩氏菌菌株KKP 1383表现出最广泛的耐药谱，对10种抗生素（AMP-CPT-CT-CRO-CIP-PEF-MXF-NOR-AK-TOB）耐药，属于4个不同类别的抗生素（青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类）。粘质沙雷氏菌菌株KKP 585和成团泛菌菌株KKP 590也表现出广泛的耐药谱，分别对9种抗菌药物耐药（粘质沙雷氏菌菌株KKP 585：AMP-AMC-CPT-CT-PEF-MXF-AK-CN-TOB；成团泛菌菌株KKP 590：AMP-AMC-FEP-CPT-CAZ-CT-PEF-MXF-AK），来自4个不同类别的抗生素（青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类）。一些抗生素对测试细菌完全无效。阴沟肠杆菌菌株KKP 575、KKP 3684、KKP 3686、KKP 3692和KKP 3706；肠杆菌属菌株KKP 3892；以及粘质沙雷氏菌菌株KKP 585和KKP 671在氨苄西林纸片存在下显示完全生长。阿莫西林/克拉维酸不能抑制阴沟肠杆菌菌株KKP 3692和肠杆菌属菌株KKP 3892的生长。此外，粘质沙雷氏菌菌株KKP 585对所有测试的氨基糖苷类抗生素（阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素）耐药（表3）。细菌菌株对选自青霉素类和头孢菌素类的抗生素表现出最高的耐药性（表4）。20株（46.5%）菌株对氨苄西林（青霉素类）表现出耐药性，而15株（34.9%）对阿莫西林/克拉维酸（青霉素类）和头孢洛林（头孢菌素类）耐药。


表4. 细菌表型抗生素耐药性的患病率

抗菌药物类别 (n=8) 抗菌药物 (n=28) 耐药菌株数 (n=43) 耐药菌株百分比 (%)
青霉素类 β-内酰胺类抗生素 头孢菌素类 碳青霉烯类 单环β-内酰胺类 氨苄西林 20 46.5
舒巴坦/氨苄西林 6 14.0
阿莫西林/克拉维酸 15 34.9
哌拉西林 0 0.0
哌拉西林/他唑巴坦 0 0.0
替卡西林/克拉维酸 0 0.0
头孢吡肟 1 2.3
头孢噻肟 0 0.0
头孢洛林 15 34.9
头孢他啶 1 2.3
头孢他啶/阿维巴坦 0 0.0
头孢洛扎/他唑巴坦 5 11.6
头孢曲松 2 4.7
厄他培南 0 0.0
亚胺培南 0 0.0
美罗培南 0 0.0
氨曲南 0 0.0
氟喹诺酮类 环丙沙星 1 2.3
培氟沙星 4 9.3
左氧氟沙星 0 0.0
莫西沙星 9 20.9
氧氟沙星 2 4.7
诺氟沙星 2 4.7
氨基糖苷类 阿米卡星 5 11.6
庆大霉素 2 4.7
妥布霉素 3 7.0
苯丙醇类 氯霉素 0 0.0
磺胺类 磺胺甲恶唑/甲氧苄啶 0 0.0


在我们的研究中，未观察到ESBL型抗生素抗性机制和碳青霉烯酶产生菌株的激活。在Richter等人的研究中，77株测试分离株中多达61株（79.2%）发现ESBL产生的阳性表型分析。一般来说，我们研究中分离的菌株未显示出高比例的多重耐药性，但由于抗生素抗性在环境中传播的风险，这种情况应受到监测。


3.4 噬菌体对细菌宿主的裂解活性评估


寻找针对优势腐生细菌的特异性噬菌体。每个分离的细菌菌株被用作扩增噬菌体颗粒的潜在宿主。从城市污水中分离出43株特异性噬菌体。通过点样法确定增殖后过滤的裂解液中噬菌体的存在。在裂解液最初滴加到接种宿主细菌菌株的平板上的位置出现特征性的大噬菌斑，表明裂解液中存在噬菌体。点样阳性测试通过将一系列裂解液稀释液常规涂布在营养琼脂平板上进行确认。孵育后，计数产生的噬菌斑，并考虑稀释度，将其转换为裂解液中的噬菌体滴度。表5呈现了从即食食品产品中分离的细菌宿主菌株以及特异性噬菌体的浓度（即噬菌体滴度）。


表5. 分离的噬菌体滴度和添加特异性噬菌体后测试细菌培养物的比生长速率系数值（n=3）

细菌菌株编号 分离来源 噬菌体滴度 [PFU mL⁻¹] 噬菌斑形态 对照培养 噬菌体感染细菌培养
感染复数 1.0 感染复数 0.1
光密度差值 比生长速率 μ [h⁻¹] 光密度差值 比生长速率 μ [h⁻¹] 光密度差值 比生长速率 μ [h⁻¹]
KKP 3706 芝麻菜 1.4×10⁹ 清晰噬菌斑 0.397 0.062 0.207 0.033 0.310 0.049
KKP 3655 芝麻菜 6.2×10⁹ 清晰噬菌斑 0.255 0.031 0.136 0.017 0.273 0.025
KKP 3800 芝麻菜 1.1×10⁷ 清晰噬菌斑 0.206 0.021 0.089 0.008 0.105 0.011
KKP 3801 芝麻菜 5.8×10⁷ 清晰噬菌斑 0.300 0.042 0.156 0.021 0.185 0.026
KKP 3825 芝麻菜 1.9×10⁷ 清晰噬菌斑 0.206 0.022 0.019 0.002 0.090 0.008
KKP 3651 芝麻菜 9.4×10⁷ 清晰噬菌斑 0.217 0.019 0.024 0.002 0.094 0.009
KKP 3889 混合叶沙拉配胡萝卜 6.4×10⁶ 清晰噬菌斑 0.218 0.021 0.150 0.013 0.167 0.015
KKP 575 混合叶沙拉配胡萝卜 2.2×10⁸ 清晰噬菌斑 0.247 0.020 0.008 0.002 0.168 0.015
KKP 1384 混合叶沙拉配胡萝卜 3.5×10⁷ 清晰噬菌斑 0.215 0.019 0.152 0.013 0.184 0.015
KKP 3082 混合叶沙拉配胡萝卜 1.4×10¹⁰ 0.312 0.026 0.147 0.019 0.261 0.023
KKP 3687 混合叶沙拉配胡萝卜 2.6×10⁷ 清晰噬菌斑伴晕圈 0.413 0.036 0.287 0.024 0.412 0.032
KKP 3824 混合叶沙拉配胡萝卜 1.0×10¹⁰ 清晰噬菌斑 0.258 0.022 0.081


缩写：芝麻菜；胡萝卜混合叶沙拉；甜菜根混合叶沙拉；清洗菠菜；未清洗菠菜；CPH-透明噬菌斑带晕圈；CP-透明噬菌斑；TP-浑浊噬菌斑。


还使用Bioscreen C自动微生物生长曲线分析仪测定了分离噬菌体的裂解活性。为此，为每个菌株制备了生长曲线，从而能够为每个噬菌体选择适当的感染率（MOI 1.0或0.1）。使用Bioscreen C自动生长分析仪进行的光密度测量使我们能够确定测试细菌菌株对数生长期的开始和持续时间，这些菌株有意以MOI 1.0和0.1的感染率感染互补噬菌体，与对照培养物相比。研究的四株噬菌体（即针对阴沟肠杆菌菌株KKP 3082的肠杆菌噬菌体KKP 3262、针对路德维希肠杆菌菌株KKP 3083的肠杆菌噬菌体KKP 3263、针对泉居沙雷氏菌菌株KKP 3084的沙雷氏菌噬菌体KKP 3264和针对弗氏柠檬酸杆菌菌株KKP 3655的柠檬酸杆菌噬菌体KKP 3664）在我们先前的研究中进行了全面表征，基因组序列已存入GenBank数据库。此外，另外三株产酶噬菌体（即针对液化沙雷氏菌菌株KKP 3654的沙雷氏菌噬菌体KKP 3708、针对粘质沙雷氏菌菌株KKP 3687的沙雷氏菌噬菌体KKP 3709和针对阴沟肠杆菌菌株KKP 3684的肠杆菌噬菌体KKP 3711）由Shymialevich等人描述。


表5显示了添加噬菌体后从选定即食食品产品中分离的菌株培养物的光密度变化。噬菌体感染样品中较低的比生长速率系数表明测试菌株对数生长期细胞分裂的显著减少。使用MOI 1.0的感染率在抑制细菌宿主细胞分裂方面比较低的感染率（MOI 0.1）更有效。将弗氏柠檬酸杆菌菌株KKP 3655与MOI 1.0的互补噬菌体一起培养，与对照培养物相比，比生长速率几乎降低了两倍。



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