摘要
生物膜通常是慢性人类感染的原因，并污染工业或医疗设备。传统方法是使用增加浓度的抗生素，但微生物迅速对其产生多重耐药性。因此，我们研究了使用天然物质作为替代解决方案。基于定植区域的生物膜定量使用配备图像分析软件的Cellavista自动显微镜进行测量。
使用Cellavista设备为固着细胞的定性和定量带来了新的可能性。在我们的研究中，通过探索两性霉素B、黄芩素、壳聚糖和地衣酸对酵母生物膜形成的抗真菌/抗生物膜活性，记录了这一特性。
在96孔聚苯乙烯微孔板中研究了这些物质对机会致病酵母近平滑念珠菌和克鲁斯念珠菌生物膜形成和根除的影响。虽然两性霉素B不是很有效，但发现使用黄芩素和壳聚糖，即使在最小抑制浓度下，也能迅速减少孔中的定植区域。地衣酸即使在浓度300μg ml⁻¹下也未显示任何显著的抗生物膜特性。我们的结果表明Cellavista是研究酵母生物膜形成和抗菌剂效果的有前途的工具。
1.引言
生物膜是高度组织化的基质包裹微生物群落，不可逆地附着于表面、相界面或彼此。这些微生物群落经常污染医疗仪器或工业设备，并引起广泛的人类感染。治疗这些感染的一大问题是生物膜对常用抗生素的高抗菌耐药性。生物膜中的微生物比浮游细胞更具耐药性。
自然界中几乎99%的微生物能够以生物膜形式生长，在其中定植各种表面。细菌生物膜及其相关感染通常比其他微生物引起的生物膜得到更广泛探索。然而，酵母生物膜，尤其是念珠菌属生物膜，也能引起非常严重的人类感染。
念珠菌属是从医院感染或医疗仪器上形成的生物膜中最常分离的酵母之一。白念珠菌通常被指定为最广泛传播的机会致病酵母，但近平滑念珠菌已成为许多研究中日益关注的主题。近平滑念珠菌引起多种疾病，特别是在免疫缺陷患者中。这些疾病包括真菌血症、心内膜炎、脑膜炎、关节炎、眼部感染、外阴阴道炎、尿路感染和关节疾病。虽然一些近平滑念珠菌菌株对多烯抗菌剂敏感，但其他已产生耐药性。克鲁斯念珠菌被认为致病性较低但比其他念珠菌属更疏水。这一因素在导致宿主表面定植的初始事件中起重要作用。在此背景下，该酵母物种能够引起一系列临床表现，如真菌血症、眼内炎、关节炎和心内膜炎。
仍然广泛用于抗真菌感染的抗生素是多烯抗生素两性霉素B，尽管它有相当严重的副作用。最严重的是肾毒性，可能导致肾衰竭。
因此，注意力转向使用具有抗菌、抗真菌和抗生物膜特性的天然物质，这些物质可能有助于治疗酵母生物膜感染。这些物质可以低浓度使用，对患者无负面影响，且不会产生耐药性。此类天然物质的例子包括多酚、黄酮类、二苯乙烯类、萜类、多糖和常用香料的活性化合物。
多种显微镜技术已用于研究生物膜。这些方法包括光学显微镜、扫描激光共聚焦显微镜、扫描和透射电子显微镜、原子力显微镜等。光学显微镜结合图像分析将生物膜视为粘附细胞覆盖的二维区域，被认为是生物膜观察的基本方法。光学显微镜和图像分析的结合已用于评估粘附细胞数量、面积覆盖度、次要应用包括确定粘附细胞的生物体积以及实时观察细菌粘附和生物膜生长。
本文的目的是报告应用Cellavista设备作为一种新方法研究酵母生物膜及其对抗菌剂响应的可能性。该应用通过观察用天然物质而非抗生素处理真菌生物膜来证明。Cellavista自动显微镜在生物膜分析中的优势之一是可以自动拼接单个图片并随后对这些大表面进行图像分析。这通过消除生物膜的自然变异性以及检测不同生物膜排列的变化（例如由于生物膜环境中天然物质的存在）显著细化最终结果。使用Cellavista设备提供的图像分析，我们显示黄芩素、壳聚糖和地衣酸在治疗近平滑念珠菌和克鲁斯念珠菌生物膜中的积极作用，并将此类处理与两性霉素B的效果进行比较，从而证明Cellavista可作为快速、可靠的工具用于确定抗菌剂对生物膜的效率。
2.方法
2.1.真菌菌株和生长培养基
近平滑念珠菌DBM 2165和克鲁斯念珠菌DBM 2163由UCT Prague微生物收藏库友好提供。储备培养物在-70°C储存，并在每次实验前在30°C麦芽提取物培养基中好氧预培养。实验也在麦芽提取物生长培养基中进行。
2.2.抗真菌剂
黄芩素、壳聚糖、地衣酸和两性霉素B购自Sigma-Aldrich。黄芩素和地衣酸溶解于DMSO（所有测定中培养基中DMSO最终浓度最高为1%）至浓度0.004和0.03μg ml⁻¹，壳聚糖通过溶解于少量乙酸（最多总体积的2%）然后在无菌蒸馏水中至浓度0.073μg ml⁻¹制备，两性霉素B溶解于无菌蒸馏水至浓度0.029μg ml⁻¹。每种物质在4°C储存直至使用（最多一周）。
2.3.抗真菌活性
黄芩素、壳聚糖、地衣酸和两性霉素B的最小抑制浓度通过微量稀释法测定。培养在100孔微孔板中使用Bioscreen C生长曲线分析仪进行，通过监测光密度（OD宽波段=420-580 nm）。将30μl标准酵母细胞悬浮液（OD600 nm=0.1）加入板每孔。包括无药物和无酵母对照。板在30°C孵化24小时。MIC指定为孵化过夜后不允许可见生长的最低浓度。实验对每种浓度进行五个重复孔。
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