研究简介
梭菌（Clostridia）是一类革兰氏阳性厌氧细菌，在医学、工业及环境领域具有重要价值，但其遗传操作工具匮乏，限制了对其基因组功能的研究和生物技术应用。本研究以模式梭菌Clostridium phytofermentans为对象，开发了一种结合靶向内含子（targetron）和Cre重组酶的基因组工程系统，实现了大规模、无标记的基因组删除与插入，为梭菌的基因功能研究和代谢工程提供了关键技术支撑。研究人员设计了一套质粒系统，通过靶向内含子将特定的lox位点（如lox71、lox66）精确插入基因组目标位置。随后，利用Cre重组酶介导位点特异性重组，实现大片段DNA的删除或外源基因的插入。通过靶向内含子将lox71和lox66位点分别插入原噬菌体区域两端，Cre重组后成功删除39 kb的50个基因原噬菌体岛，并通过PCR和测序验证删除效率达100%。采用重组介导的盒式交换（RMCE）策略，将带有异源spacer的lox511/71和loxFAS/66串联cassette插入基因组中性位点（如cphy1575），再通过Cre重组将诱导型荧光报告基因（P3368-FbFP）整合到基因组中，实现碳源依赖性表达。研究人员还通过重组介导的盒式交换（RMCE）在基因组中中性位点插入了一个可诱导的荧光报告基因，该方法利用基因组和质粒上的串联lox位点以及特异性间隔，防止盒式内重组。这些方法普遍为梭菌的无标记基因组工程提供了便利，有助于研究其基因组结构和调控机制。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪用于精确、高效地监测不同遗传修饰菌株在不同碳源上的生长表现。评估原噬菌体删除对菌株代谢适应性影响时，全自动生长曲线分析仪用于比较野生型（WT）、双插入菌株（DI-SS）和原噬菌体删除菌株（Del-SS）在四种碳源（葡萄糖、纤维二糖、木糖、半乳糖）上的生长曲线。在100孔微孔板中同时培养多组菌株（每组4个重复），确保数据统计可靠性，板孔在厌氧舱（2%H₂,98%N₂）中密封，模拟梭菌的严格厌氧生长条件。每孔在600 nm波长下自动测定光密度（OD₆₀₀），并通过周期性震荡（每次读数前震荡30秒）保证菌液均匀性。
实验结果
本研究成功开发并验证了一种基于靶向内含子（targetron）与Cre重组酶的基因组工程系统，实现了在模式梭菌Clostridium phytofermentans中进行大规模、精准且无标记的基因组删除与插入。通过靶向内含子将优化的lox71和lox66位点精准插入基因组原噬菌体区域（cphy2944-cphy2993）两侧，Cre重组酶介导的位点特异性重组成功删除了39 kb的50个基因片段。实验表明，当两个lox位点方向一致时，重组后稳定保留lox72位点；若方向相反，则因反向重复序列的不稳定性导致大部分片段丢失，仅残留短疤痕。这一发现为后续基因组编辑中位点方向设计提供了重要参考。删除原噬菌体区域后，突变株在葡萄糖上的生长与野生型无差异，但在纤维二糖、木糖等非偏好碳源上生长显著受限，表明原噬菌体基因可能通过调控代谢适应性参与宿主应激响应。RNA-seq数据进一步揭示，原噬菌体中的cphy2976基因在非葡萄糖碳源中表达上调数十倍，提示其可能作为关键因子影响宿主代谢网络。通过重组介导的盒式交换（RMCE），将携带异源spacer的lox511/71-loxFAS/66cassette整合至中性基因组位点（cphy1575），并进一步利用Cre重组酶将诱导型荧光报告基因（P3368-FbFP）精准插入。该荧光蛋白在纤维二糖诱导下表达显著增强，证明了其作为碳源响应型报告工具的可行性。靶向内含子-Cre重组酶系统填补了梭菌基因组编辑技术的空白，通过精准操控大片段DNA，为理解梭菌生物学特性及开发其工业应用奠定了方法论基础。
图1、C.phytofermentans基因组缺失与插入概览.(A)pQlox71引入，通过targetron编码的LtrA蛋白在基因组中插入lox71（L71）位点。(B)pQlox71清除后，引入pQlox66，在基因组中插入lox66（L66）位点。(C)pQlox66清除后，引入pQcre1，Cre介导重组删除lox66与lox71位点间的序列。(D)通过PCR确认缺失和lox72位点（箭头表示引物位置）。(E)引入pQadd1，将lox511/71（L5-71）和loxFAS/66（LF-66）盒送入基因组。(F)pQadd1清除后，引入pQadd2，携带目标插入序列，位于lox511/66（L5-66）和loxFAS/71（LF-71）位点之间。(G)引入pQcre2，实现Cre介导的RMCE。(H)得到的株基因组中插入序列被lox511/72（L5-72）和loxFAS/72（LF-72）夹持，通过PCR确认（箭头表示引物）。
图2、在C.phytofermentans中构建targetron插入lox71（cphy2944）与lox66（cphy2993）株。(A)基因组区域及lox盒targetron插入位点。显示B与E面板使用的引物位置。(B)对3个DI-AS分离株（DI1-DI3）通过PCR确认lox71插入cphy2944（引物2944_1/2）与lox66插入cphy2993（引物2993_1/2）。(C-D)DI1的DNA测序色谱图：cphy2944中lox71位点（C），cphy2993中lox66位点（D），红色显示臂突变，8-bp中央间隔标出。(E)逆向PCR（引物int_1/2）显示3个DI-AS分离株仅含预期的2个基因组targetron插入。3.5 kb条带对应cphy2944插入，1.3 kb条带对应cphy2993插入。
图3、Cre介导的基因组缺失。(A)PCR检测cphy2944（引物2944_1/2）、cphy2993（引物2993_1/2）及38.9 kb区域（引物2944_1/2993_2），比较pQcre1转化前（DI-SS、DI-AS）与转化后（Del-SS、Del-AS）。(B-C)Del-AS中内含子片段（B）和Del-SS中lox72位点（C）的DNA测序色谱图，红色标出回文位置或中央间隔。(D-E)Cre介导lox71与lox66之间基因组缺失模型：Del-AS株为双向内含子重组成28-bp内含子片段（无lox72），Del-SS株为单向内含子（含lox72）。
图4、C.phytofermentans WT、DI-SS与Del-SS的生长曲线。在葡萄糖（A）、纤维二糖（B）、木糖（C）、半乳聚糖（D）上测量。数据点为4个培养物均值，阴影区为标准差（SD）。(E-H)RNA-seq测量WT在不同碳源条件下cphy2944-cphy2993的mRNA表达（log2(RPKM)±SD，重复培养物）；星号表示相对于葡萄糖的差异表达基因。
图5、C.phytofermentans中RMCE基因组插入。(A)int1575株cphy1575区域示意图，包括PCR引物位置（1575_1/2）及targetron数目（int_1/2）。(B)PCR显示WT与int1575株（引物1575_1/2）中targetron含lox511/71-loxFAS/66盒的插入。(C)int1575基因组逆向PCR（引物int_1/2）显示仅有单个targetron插入，5.1 kb条带对应预期cphy1575插入。(D)pQadd2与pQcre2可在int1575株中共存，通过PCR检测质粒复制子来源，比较转移前后状态。(E)int1575_FbFP株中cphy1575区域示意图，显示RMCE插入P3368-FbFP盒。(F)PCR显示P3368-FbFP盒成功插入int1575_FbFP。(G)荧光测定（激发448/20 nm，发射495/20 nm）显示WT与int1575_FbFP株纤维二糖诱导表达FbFP，条形图为三重复培养的平均荧光值标准化OD600±SD。
总结
本研究成功开发并验证了一种基于靶向内含子（targetron）与Cre重组酶的基因组工程系统，实现了在模式梭菌Clostridium phytofermentans中进行大规模、精准且无标记的基因组删除与插入。设计了一套质粒系统，通过靶向内含子将特定的lox位点（如lox71、lox66）精确插入基因组目标位置。随后，利用Cre重组酶介导位点特异性重组，实现大片段DNA的删除或外源基因的插入。通过靶向内含子将lox71和lox66位点分别插入原噬菌体区域两端，Cre重组后成功删除39 kb的50个基因原噬菌体岛，并通过PCR和测序验证删除效率达100%。
采用重组介导的盒式交换（RMCE）策略，将带有异源spacer的lox511/71和loxFAS/66串联cassette插入基因组中性位点（如cphy1575），再通过Cre重组将诱导型荧光报告基因（P3368-FbFP）整合到基因组中，实现碳源依赖性表达。本研究不仅为梭菌基因组功能解析提供了关键工具，还通过原噬菌体删除和报告基因插入案例，展示了其在代谢工程（如生物燃料生产）和环境适应性研究中的潜力。该系统的通用性设计暗示其可扩展至其他难操作的厌氧细菌，推动微生物资源的开发与利用。靶向内含子-Cre重组酶系统填补了梭菌基因组编辑技术的空白，通过精准操控大片段DNA，为理解梭菌生物学特性及开发其工业应用奠定了方法论基础。
Bioscreen C提供的生长动力学数据是连接基因操作（原噬菌体删除）与表型变化的直接证据，弥补了分子生物学工具（如PCR、测序）无法反映功能缺陷的局限，通过高通量、可控的厌氧培养与动态监测，揭示了原噬菌体删除对碳源代谢的负面影响，凸显了其在微生物遗传学研究中对精细表型解析的价值。
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