摘要
工业过程和含氮肥料的使用导致硝酸盐污染环境，这是一个全球范围内日益严重的问题。虽然硝酸盐可以通过微生物反硝化作用从污染区域去除，但硝酸盐经常与其他污染物（如重金属）共存，这些污染物可能阻碍该过程。本文使用与橡树岭保护区（ORR）污染环境中观察到的相似浓度的硝酸盐和金属（Al、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Cd和U），从ORR的地下水和沉积物中富集和分离了硝酸盐还原微生物。对七种新的耐金属硝酸盐还原菌株进行了表征，并检查了它们在ORR未污染和污染区域的分布。虽然这七种菌株具有不同的生长pH范围、碳源偏好以及对单个和组合金属的耐受程度，但所有菌株在存在和不存在ORR污染环境中发现的金属混合物的情况下，都能以相似的速率还原硝酸盐。通过精确16S RNA序列变异分析，在ORR不同位置的地下水样品中鉴定出四种菌株，所有四种都出现在未污染和污染区域。通过使用环境相关金属浓度，我们成功地从ORR未污染和污染环境中分离出多种微生物，这些微生物能够在极端混合金属污染存在下还原硝酸盐。
硝酸盐污染是影响地下水质量的全球性问题。在某些情况下，地下水同时被硝酸盐和重金属混合物污染可能降低微生物介导的硝酸盐去除，从而延长硝酸盐污染的持续时间。本文使用橡树岭保护区污染点存在的金属和硝酸盐浓度，分离出七种耐金属菌株。所有菌株都能在高浓度重金属混合物存在下还原硝酸盐。七种菌株中的四种位于橡树岭保护区的原始和污染点。对这些硝酸盐还原菌株的进一步研究将揭示耐多种金属的机制，增加我们对硝酸盐和金属污染对地下水微生物群落影响的理解。
人为破坏氮循环是一个日益严重的全球性问题，导致了多种环境和人类健康相关问题。特别是，氮基肥料和化石燃料使用的增加导致人类活动产生反应性氮物种的速率超过了自然过程去除它们的速率。这引发了一系列负面环境后果，如沿海富营养化、酸雨以及因硝酸盐污染导致的地下水质量下降。消费硝酸盐污染的地下水可能引起婴儿高铁血红蛋白血症，并可能是特定类型癌症的风险因素。
橡树岭保护区（ORR）位于田纳西州，包含一个高度污染的点，同时含有硝酸盐和多种重金属。这源于1951年至1983年期间，ORR Y-12工厂的核处理活动将酸性含铀和硝酸盐废物排放到四个容量为950万升的池塘中。1978年，池塘中的液体pH值范围为0.8至5.3，硝酸盐浓度高达74 g/升（1.2 M），同时含有高浓度的各种金属，包括铝（4.9 g/升）、锰（0.024 g/升）、镍（0.13 g/升）以及铀（0.32 g/升）。1983年，池塘中的液体被中和，resulting污泥沉淀。液体被移除，池塘被覆盖并改建成停车场。目前有五个大型污染羽流从所谓的S-3池塘延伸出来。周围地下水中的污染物不仅包括硝酸盐（高达11.6 g/升，190 mM）和U（140 mg/升），还包括多种金属，如铝（560 mg/升）、锰（170 mg/升）和镍（9.4 mg/升）。因此，ORR S-3池塘是美国在硝酸盐和金属污染方面最严重的点之一。
硝酸盐通常通过反硝化作用从土壤和地下水环境中自然去除，这是一个厌氧或微好氧呼吸过程，微生物将还原电子源的氧化与硝酸盐的还原耦合，而不是氧气。形成的亚硝酸盐随后被亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶分别还原为一氧化氮、一氧化二氮和最终氮气，尽管许多微生物只执行途径中的某些步骤。硝酸盐还原酶催化反硝化途径的第一步，有两种类型。呼吸硝酸盐还原酶是一种三聚体跨膜蛋白，由narGHI编码，需要钼（Mo）以钼蝶呤鸟嘌呤二核苷酸（MGD）辅因子形式存在于NarG的活性位点。NarH含有铁硫簇，而NarI含有细胞色素b。相反，一些生物含有一种二聚体周质硝酸盐还原酶，由napAB编码。NapA也需要Mo与MGD辅因子配位，NapB含有细胞色素c。
已知几种环境因素对土壤中微生物反硝化很重要，包括还原剂来源以及低氧浓度。土壤pH值也会影响反硝化，如果pH值低于6.0，会导致速率降低并形成一氧化二氮作为主要终产物而非氮气。Mo可用性也影响土壤中硝酸盐还原。实际上，在ORR硝酸盐污染点，尽管存在高浓度的各种其他金属，但一些污染最严重的地下水样品中Mo仅以皮摩尔浓度存在。提出高浓度可溶性Fe和Al在污染环境中形成沉淀，当酸性污染地下水与周围土壤混合时。这些沉淀物结合并吸附钼酸盐（Mo的可溶形式），使其无法被微生物用于硝酸盐还原。
污染环境中高浓度金属是另一个可能阻碍硝酸盐还原的因素。采矿作业废水通常含有高浓度金属（如Fe和Ni）以及硝酸盐（由于使用硝酸铵基炸药和氰化物作为浸出剂）。当研究模拟矿水金属对硝酸盐去除速率的影响时，发现50和100 mg/升Ni分别使其降低18%和65%。不锈钢生产中的酸洗过程导致冶金废水含有高浓度硝酸盐和各种金属（包括Fe、Cr和Ni），这些已测试其对废水污泥反硝化的影响。发现Fe（25 mg/升）和Cr（100 mg/升）降低整体反硝化，而Ni（5 mg/升）导致反硝化中间体（NO2-和N2O）积累。此外，在一项盐沼沉积物研究中，报告称反硝化速率被多种金属在1 g/升时降低，包括Pb、Ni、Cr、Zn、Cu、Fe和Cd。结论是金属污染可能改变海洋沉积物中氮循环的动态。
在ORR的先前研究中，使用16S rRNA、nirK和nirS基因序列调查了未污染和污染环境中硝酸盐还原微生物群落，但未分离关键微生物。在本研究中，我们的目标是表征能够在极端金属污染条件下还原硝酸盐的土著微生物。然后，我们将使用16S rRNA基因序列库映射这些菌株在93个不同未污染和污染ORR地下水井中的分布。使用基于ORR污染环境中发现的硝酸盐和金属混合物浓度，富集并分离出总共七种硝酸盐还原细菌菌株。所有七种菌株在生长于污染ORR环境金属混合物（COMM）存在下保持硝酸盐还原酶活性，并且通过精确序列变异（ESV）分析，七种菌株中的四种在ORR未污染和污染地下水井中被鉴定。我们提出这些菌株可以作为模型，用于理解在极端污染环境中高浓度金属混合物存在下如何减轻硝酸盐污染。
相关新闻推荐
1、乙醇耐受性梭菌菌株生长、基因组学、途径工程及发酵特性（二）
2、类肠膜魏斯氏菌对猪生长性能、粪菌和代谢产物的影响——摘要、材料与方法