讨论
为了了解哪些鼠疫耶尔森菌基因对跳蚤肠道定植和适应以产生生物膜阻塞介导的可传播感染至关重要，我们先前定义了阻塞跳蚤中鼠疫耶尔森菌与LB体外生长条件相比的独特转录组。假设在跳蚤肠道环境中独特地高度诱导的基因优先用于跳蚤适应和传播，这促使需要功能性地理解它们在鼠疫耶尔森菌跳蚤感染期间的作用。本研究旨在表征一个这样的基因——编码LTTR的rovM的功能作用。
我们来自本研究的数据表明，rovM可能在鼠疫耶尔森菌跳蚤感染期间被可用的碳源和氮源或可能其他环境因素诱导。rovM突变体在与野生型共感染期间表现出的竞争适应性缺陷表明，缺乏RovM导致在获取跳蚤肠道中可用营养物质方面存在缺陷。我们先前表明，鼠疫耶尔森菌在跳蚤肠道中具有独特的代谢特征，主要表现为主要利用肽和氨基酸以及脂质和一些戊糖碳水化合物利用。具体来说，在跳蚤中，二乙酰壳二糖（chbBC,chbF）、精氨酸（artQ）和谷氨酰胺（glnQPH）的摄取和分解代谢相关基因的诱导与rovM诱导表达同时发生。在本研究中，我们证明了这三种代谢物在体外支持过表达rovM的鼠疫耶尔森菌的生长适应性优势。或者，己糖的分解代谢被认为在跳蚤肠道中不显著，我们观察到rovM过表达不影响鼠疫耶尔森菌在存在己糖（葡萄糖、半乳糖或麦芽糖）的情况下的生长适应性。跳蚤血餐及其通过跳蚤及其固有肠道微生物群消化产生的分解代谢产物，是鼠疫耶尔森菌在跳蚤肠道中存活和生长的营养来源。因此，鼠疫耶尔森菌可能不仅与跳蚤及其常驻微生物群竞争血餐，而且可能需要能够利用跳蚤及其微生物群产生的血餐消化副产物。转录调节因子RovM可能指导更有效地利用跳蚤肠道中一些可用营养物质，以支持鼠疫耶尔森菌对该环境的适应。当然，过表达rovM的△rovM pACrovM菌株在与野生型共感染期间表现出的改进适应性支持了这一观点。这种响应营养线索的能力是RovM同源物的一项功能。例如，大肠杆菌中的LrhA负调节半乳糖和天冬氨酸趋化受体，从而响应这些营养物质的获取来控制细菌运动性；假结核耶尔森菌的RovM在基本培养基中培养时被诱导；嗜线虫致病杆菌的LrhA支持这种昆虫病原体在含有特定氨基酸的基本培养基中繁殖，而ΔlrhA突变体在LB培养基中与野生型菌株相比没有生长差异。Richards和Goodrich-Blair提出，代谢物可以作为转换信号，使病原体能够从毒力活动切换到代谢活动，或者感染期间特定营养物质的消耗可能作为表达传播所需基因的信号。
我们的结果表明，在复杂的丰富LB培养基中，增强的rovM表达导致较少的附着生物膜形成，而在含有精氨酸的营养限定TMH培养基中，产生更多的生物膜。此外，rovM过表达与在基本培养基中存在精氨酸时更快的生长速率相关。这共同暗示RovM通过整合营养线索影响生物膜形成，并且精氨酸可能是这种信号传导的核心。这与代谢物可能作为转换信号的观点一致。鼠疫耶尔森菌的生物膜形成仅发生在跳蚤宿主中，并且对于鼠疫的生物膜介导传播以及维持跳蚤肠道的持续定植非常重要。hms基因组，包括hmsHFRS基因位点和单基因hmsT和hmsP，负责合成和调节细胞外多糖基质（ECM），这是生物膜形成的基础。ECM促进生物膜介导的传播和跳蚤肠道中的持久性。多胺也通过调节HmsR和HmsT蛋白翻译而成为鼠疫耶尔森菌生物膜形成所必需的。有趣的是，精氨酸是多胺生物合成第一步中所需的前体，在那里它通过精氨酸脱羧酶转化为胍丁胺。
只有通过反式过表达rovM基因（例如本实验中的pACrovM和pCR_rovM）在ΔrovM突变体和野生型细菌中发生的rovM转录水平升高，导致生物膜、跳蚤感染和生长适应性的显著改变。这与针对假结核耶尔森菌和大肠杆菌RovM同源物的研究一致，其中只有当RovM水平升高时才能与显著不同的异常表型相关联，而野生型和RovM同源物突变株之间没有出现明显差异。例如，假结核耶尔森菌中RovM水平升高导致运动过度和小鼠毒力减弱，而野生型和ΔrovM突变株之间没有明显差异。此外，在大肠杆菌中质粒介导的lrhA过表达的情况下，与携带空质粒的lrhA突变体相比，运动性降低。假结核耶尔森菌RovM的晶体结构揭示可能需要代谢诱导分子来介导其折叠成活性四聚体单元。因此，四聚体单元的形成对于RovM调节功能至关重要，这与其他LTTRs的功能一致。那么可以假设，rovM的反式过表达将导致比野生型和ΔrovM更多功能活性的RovM单位，后者合成很少或不合成rovM转录本。LTTRs的另一个标志是自我调节，并解释了诱导的RovM合成导致rovM表达的进一步诱导。基于pACYC177质粒的拷贝数，预计△rovM（pACrovM）菌株中存在2-15个rovM基因拷贝。因此，在pACrovM转化菌株中诱导rovM表达可能导致rovM的进一步诱导，从而解释了这些菌株与野生型和ΔrovM菌株在LB和SMM培养基中rovM表达的显著差异。
在rovM被诱导或过表达的条件下，如在pACrovM和pCR_rovM转化菌株中观察到的，或自然发生在跳蚤感染期间，存在更多功能性RovM单位来介导rovA抑制或代谢过程调节。RovM诱导的营养特异性以及RovM依赖性rovA抑制在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌中是不同的。鼠疫耶尔森菌在跳蚤中生长时rovM的诱导及其对rovA的抑制，与假结核耶尔森菌在低温基本培养基中体外生长时发生的情况相符。然而，鼠疫耶尔森菌ΔrovM突变体在昆虫宿主中生长时维持低rovA转录，这与假结核耶尔森菌RovM介导的rovA抑制形成对比。看来鼠疫耶尔森菌rovA在跳蚤肠道和SMM葡萄糖中的调节不是通过RovM介导的，可能还需要其他调节因子，类似于假结核耶尔森菌中温度和生长阶段依赖性的rovA表达。
鼠疫耶尔森菌从假结核耶尔森菌分化而来，失去了运动性、鞭毛合成和入侵蛋白的产生，这些都是RovM调节的毒力因子，可增强假结核耶尔森菌的侵袭性。独立于RovA调节运动性是RovM同源物在各种致病菌物种（例如，线虫病原体嗜线虫致病杆菌的LrhA、大肠杆菌的LrhA和植物病原体胡萝卜软腐欧文氏菌的HexA）中保守的调节功能。这些功能在鼠疫耶尔森菌中不存在，因此不再构成鼠疫耶尔森菌RovM调节子。在鼠疫耶尔森菌从假结核耶尔森菌克隆进化过程中，除了通过水平基因转移和失活获得和丧失基因功能外，基因调控和全局调控网络的重塑已经发生。这可能是鼠疫耶尔森菌适应其定植跳蚤并通过跳蚤传播能力的一个促成方面。
我们得出结论，RovM蛋白可能在营养感知和调节生理过程以有利于鼠疫耶尔森菌适应和定植跳蚤肠道方面发挥作用。RovM的这种作用在自然鼠疫循环期间，当跳蚤肠道的竞争性定植更为普遍时，对于跳蚤传播可能特别重要。
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