生物膜测定
为确定在LB培养基中形成生物膜的能力，将细菌在补充有4 mM CaCl2和4 mM MgCl2的LB肉汤中于室温培养18小时，并在相同培养基中稀释至A600nm 0.02。为确定在TMH-gal+或TMH-gal+arg培养基中形成生物膜的能力，将细菌在仅补充0.2%半乳糖的TMH中于室温培养18小时。然后将这些培养物首先在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中1:10稀释，随后在TMH-gal+或TMH-gal+arg培养基中1:400稀释。取100μl等分试样加入96孔聚苯乙烯板的孔中，并在环境室温下以250 rpm振荡培养48小时。用蒸馏水洗涤孔三次以去除培养基和浮游细胞，然后用200μl的0.05%藏红染色附着生物膜20分钟。用蒸馏水洗涤孔三次，将板干燥48小时。用200μl的30%乙酸溶解结合的藏红染料30分钟，并立即测量A450nm。测定使用3-4次独立的生物学重复，每个重复三个技术重复进行。
鼠疫耶尔森菌诱变和互补
使用pKOBEG方法创建鼠疫耶尔森菌ΔrovM突变株，其中整个靶基因被来自pUC4K的Tn703卡那霉素盒替换。使用引物对lxmarovMf/lxbarovMr和rxbarovMf/rhindrovMr通过PCR从鼠疫耶尔森菌KIM6+基因组DNA中产生rovM基因的左右侧翼区域。将这两个PCR片段分别克隆到pUC19的Xmai/XbaI和XbaI/HindIII位点。使用引物kanxbaf和kanxbar扩增卡那霉素盒，并将其克隆到含有rovM侧翼区域的pUC19质粒的XbaI位点。将新质粒pUC19rovM500flanking用作模板，使用引物lxmarovMf和rhindrovMr生成线性PCR片段，用于pKOBEG方法进行诱变。通过DNA测序验证突变。ArovM::kan突变体在此简称为ArovM。使用引物lxmarovMf和rhindrovMr从鼠疫耶尔森菌KIM6+基因组DNA生成包含rovM基因和天然启动子区域的片段，并将该片段克隆到高拷贝数质粒TOPO-pCR2.1（pCR_rovM）中。然后，通过用BamHI和XhoI消化pCR_rovM质粒分离包含rovM基因和天然启动子区域的片段，并将其克隆到低拷贝数质粒pACYC177（pACrovM）的相应位点上。通过DNA测序验证构建体。通过电穿孔分别用pACrovM或pCR_rovM转化ArovM突变体，以实现rovM突变的反式互补。用空pACYC177质粒转化鼠疫耶尔森菌ArovM突变体和野生型菌株，并用pCR_rovM构建体转化野生型菌株用于比较rovM过表达实验。除非另有说明，所有后续实验均使用携带质粒的菌株进行。本研究中使用的所有菌株和引物列于表1。
跳蚤感染
用于跳蚤感染的鼠疫耶尔森菌KIM6+（pACYC177）、△rovM突变体（pACYC177）和△rovM（pACrovM）菌株在脑心浸液（BHI）肉汤中连续培养两次，首先在28°C，然后在37°C不通气培养。离心细菌培养物，将细菌沉淀重悬于0.5 ml PBS中，并加入5 ml新鲜肝素化小鼠血液，浓度约为1X109个细胞/mL。然后让Xenopsylla cheopis跳蚤使用先前描述的人工饲喂室以受感染血液为食。摄取血餐的跳蚤在21°C和75%相对湿度下维持，每周两次以未感染小鼠为食，并在28天内监测前胃阻塞情况。通过在感染性血餐后立即、感染后7天和28天采集的20只受感染跳蚤样本中的细菌负荷（cfu计数）确定感染率。
共感染与单一感染类似地进行。让跳蚤以含有大约1:1比例的ΔrovM突变体或ΔrovM（pACrovM）与野生型菌株的血液为食。在感染后0天和28天，通过仅在耶尔森菌选择性琼脂基础（YSAB-irg）上补充1μg/μL异噻唑啉（irgasan）进行铺板，确定16-20只受感染跳蚤的细菌负荷，以确定每只跳蚤的总鼠疫耶尔森菌cfu。同时，在YSAB-irg上添加50μg/mL卡那霉素或100μg/mL羧苄青霉素进行铺板，以分别选择ΔrovM突变体或ΔrovM（pACrovM）。进行了两次独立的共感染测定。
RT-qPCR
使用RNeasy RNA分离试剂盒从三个独立的指数期培养物和跳蚤中分离RNA，并用rDnase I处理以去除污染的基因组DNA。对于从跳蚤中分离RNA，在处理感染后两周，处理约35个跳蚤肠道的三个独立重复池，如先前所述。使用Agilent Bioanalyzer 2100评估RNA质量，仅使用RIN值≥8且A260/A280比值约为2.0的样品。通过RNA的实时PCR确认样品无基因组DNA污染。按照制造商的说明，使用Superscript III逆转录酶从2-5μgs总RNA合成cDNA。每个25μL定量PCR反应使用每样品20ngs cDNA，重复三次，使用Taqman Universal PCR Master Mix在ABI Prism 7900序列检测系统上使用以下条件进行：95°C 10分钟，然后进行40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟。使用Primer Express version 2.0软件设计Taqman引物和探针组，列于表1。
所有三个基因的引物和探针组的最终使用浓度分别为500nM和250nM。对于每个引物-探针组测定，使用已知浓度的鼠疫耶尔森菌KIM6+基因组DNA制备标准曲线。标准曲线用于将CT值转换为相对DNA量。每个实验基因的cDNA量相对于参考基因crr（y1485）的量进行标准化，该基因的表达不受体内或体外生长条件的影响。S1数据集包含使用SMM培养基条件的RT-qPCR原始数据，之前尚未使用crr标准化对照基因进行RT-qPCR。每个测定对三个独立的生物学样品进行三次重复。为了计算倍数变化，我们使用两个菌株之间（感兴趣基因/crr）的标准化值的比率，例如，菌株A和菌株B之间感兴趣基因转录本的倍数变化将通过从（感兴趣基因/crr）菌株A/（感兴趣基因/crr）菌株B得出比率来计算。
统计分析
使用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。使用单因素方差分析（One Way ANOVA）和Tukey多重比较事后检验来确定生物膜形成、生长速率和转录水平的任何显著差异。对于跳蚤共感染测定，使用学生t检验来确定感染后第0天和第28天每个菌株的平均感染百分比之间的显著差异。对指数生长期进行线性回归分析以确定每个菌株的生长速率（μ）。
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