1.3实验方法
1.3.1耐冻酵母的分离筛选
将收集到的老面样本，于-18℃冷冻保藏48 h，取出融化后继续冷冻，循环5次。冻融结束后，将样品稀释到10-3～10-6梯度在YPD平板上进行纯化分离。通过显微镜下10×40倍观察菌株细胞形态，结合嗅闻法筛选具有酵母菌特征和明显香味的菌株。在本研究中，共得到5株不同菌落形态和香气特征的酵母菌株，将其标记为Y1～Y5，纯化接种后4℃保藏。
1.3.2酵母生长曲线的测定
将5株酵母于28℃下活化24 h，吸取1 mL活化后的菌液，接种到500 mL的YPD液体培养基中，每2 h取样，在波长600 nm处测定吸光度值。
1.3.3耐冻酵母发酵力的测定
采用排水法测定不同酵母菌发酵力。将100 g高筋小麦面粉，3 g酵母菌菌体(数量级均在109 CFU/g)，6 g糖，0.6 g盐和60 g蒸馏水混匀，置于和面机中，搅拌成型。分割成50 g小面团，填实于密闭瓶中，28℃、相对湿度75%条件下发酵，每30 min记录1次排水体积，绘制发酵力曲线图，其余面团用于后续实验。
1.3.4冷冻面团的制备及酵母细胞存活率测定
参考XU等的方法并修改，将添加了酵母Y1～Y5的面团，在35℃，相对湿度75%条件下预发酵10 min后在-80℃急冻冰箱中快速冷冻，当样本核心温度达到-18℃后，转入-18℃冰箱中，冷冻120 d，每20 d测定1次酵母菌存活率。根据与新鲜面团酵母活菌数比值计算酵母细胞存活率。
1.3.5面团比容、质构的测定
将上述冷冻40 d面团取出后，于醒发箱(35℃，相对湿度75%)醒发20 min后蒸制20 min，冷却后参考GB/T 21118—2007《小麦粉馒头》测定面团比容。
将冷却后的面团均匀切割为2 cm×2 cm×1 cm规格进行质构测定。选用TPA模式，采用P/50探头进行压缩试验。试验参数:测前速度2.00 mm/s，测试速度1.00 mm/s，测后速度1.00 mm/s，压缩程度50%，触发力5 g，压缩间隔5 s。
1.3.6耐冻酵母的分子生物学鉴定
将所筛选具有耐冻产香功能的酵母菌，培养成熟后采用Omega M5635真菌DNA提取试剂盒进行提取。酵母菌采用引物26SF(5-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3)，26SR(5-GGTCCGTGTTTCAAGAC-GG-3)进行PCR扩增，扩增产物由上海派森诺生物科技有限公司测序，序列利用BLAST程序在GenBank数据库中进行比对，利用Mega 6.0构建系统发育树。
1.3.7酵母菌发酵面团感官品质的测定
将筛选的耐冻产香酵母菌与3种市售酵母菌剂在相同条件下制备面团，冷冻40 d，取出后，于醒发箱(35℃，相对湿度75%)醒发20 min后蒸制20 min，冷却后参考国标GB/T 35991—2018《粮油检验小麦粉馒头加工品质评价》中馒头品质评分项目，选择10名食品专业相关人员，按评定表1对熟面团进行感官评定。
表1冷冻面团感官评定表
1.3.8发酵面团香气成分测定
香气萃取:称取3 g蒸制的面团于顶空萃取瓶中，置于80℃恒温水浴锅中，待样品完全解冻且温度稳定，平衡20 min。萃取头插入顶空萃取瓶中吸附40 min后开始进样分析，解析8 min。
GC条件:使用气相色谱柱，以He为载气，进样口温度为250℃，不分流进样，流速1.0 mL/min，升温程序:40℃保持3 min，以4℃/min升温至200℃，5℃/min升至230℃，保留5 min。
MS条件:电子电离源;电子能量70 eV;离子源温度230℃;接口温度250℃;质量扫描范围35～400 u。
1.4数据处理
采用SPSS 25.0、Excel 2019软件进行数据相关性统计分析，结果用origin 21软件作图表示。偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)采用SIMCA 14.1绘制。每组样本进行3次平行测定。
2结果与分析
2.1不同酵母的生长曲线、发酵力、耐冻性能的测定
传统老面团中微生物具有复杂性，包含多种与风味和品质存在显著关联性的微生物，被广泛用于特色发酵菌株的筛选。如图1所示，实验前期筛选了5株具有耐冻、产香特性的酵母菌，测定了菌株的生长曲线、发酵力及冻藏后存活率。5株菌株的OD值随培养时间延长呈先增加后降低的趋势，其中8～24 h微生物生长明显加快，这与李欢欢等的研究结果一致，该阶段酵母菌以指数增长的速率繁殖，利于酵母菌的收集。Y2在4～32 h的OD值始终高于其他几株酵母，并且在20 h即达到生长最高点，说明Y2酵母生长速率较其他菌株更快。
a-生长曲线;b-发酵力;c-冷冻后存活率
图1不同酵母菌的生长曲线、发酵力及冷冻后存活率
酵母菌在繁殖代谢过程中，水解糖经发酵释放CO2，通过测定发酵力评判酵母菌产气能力的强弱，对于冷冻生坯面团醒发具有重要作用，发酵力越强的菌株，能够使面团在发酵期间产生大量气体膨胀，质地更加松软。如图1-b所示，各株酵母菌在30 min前产气量差异较小，随后产气量显著增长，在180 min后逐渐稳定，5株菌株当中Y2发酵力最强。
面团在低温冷冻过程中，冷冻胁迫对酵母细胞具有严重破坏性，酵母菌会受冻融、高渗透压和氧化应激等各种条件协同影响，引起细胞凋亡。如图1-c所示，各面团在0～60 d时间内酵母菌存活率快速下降，随后下降趋势放缓。酵母细胞存活率曲线趋势与刘海东等对酵母菌多次冻融后的结果相似，由于冻藏过程中在高渗、低温及冰晶带来的机械损伤下，酵母菌细胞膜的组成和结构完整性受到影响，另一方面冰晶的形成使胞外基质浓度升高，胞内渗透压增大，导致细胞迅速脱水死亡。而随着冻藏时间的延长，冷冻耐受型酵母菌能够通过调节基因表达，以反渗透作用将细胞内水分快速排出胞外，以减少胞内冰晶形成和对细胞伤害。同时耐冷冻酵母能够通过积累代谢物如胞内海藻糖等方式保护细胞免受损伤。Y2在整个冻藏过程中存活率均高于其余菌株，证明了该酵母具有较强的抗冻稳定性。
2.2耐冻酵母对面团比容及质构特性的影响
传统冷冻面团储藏过程中不可避免的会导致面团品质劣化，适口性降低。冷冻引起组织水分分布状态改变，结合水向可冻结水转化，冰晶数量的增多以及重结晶的不断出现使面筋网络遭到破坏，导致产品硬度增加、出现开裂现象，因此酵母菌二次醒发过程对面团质构的维持至关重要。由表2可知，5株酵母发酵的冷冻面团中，Y2组比容和高径比显著高于其他面团(P<0.05)，咀嚼性为372.32 mJ，硬度为611.73 g，显著低于其他样本(P<0.05)。杨锦胜等、苏安祥等研究结果表明，硬度与咀嚼性在一定范围内与面团的食用品质呈负相关性，即硬度和咀嚼性数值越大，面团口感越差。这是由于冷冻复蒸后面团的持水力减弱，导致硬度和咀嚼性增大，使得面团缺乏绵软口感。因此Y2发酵面团冷冻后的质构特性要优于其他菌株，表明了其良好的耐冷冻和快速产气性能，这与之前的发酵力和存活率测定结果一致。
表2不同冷冻面团的比容和质构特性
注:同列不同小写字母表示存在显著性差异(P<0.05)。
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