2 结果与分析
2.1 产香酵母的分离纯化
参照《真菌鉴定手册》和《酵母菌的特征与鉴定手册》，对分离纯化出的菌株进行形态学、生理生化鉴定。酵母菌菌落多数呈乳白色，极少数为红色，个别为黑色。酵母菌的菌落表面大多数光滑、湿润、黏稠，容易被挑起；小部分干燥、覆盖有细小绒毛，难以挑取。酵母菌的菌体形态各样，包括球状、卵圆形、椭球形、柱状、香肠状等。通过对酵母菌菌落特征观察和染色镜检，确定出16株具有典型酵母特征的菌株，其菌落、菌体形态和酵母菌形态学分析结果见表2。
2.2 产香酵母的初筛
嗅闻YPD固体培养基表面生长的酵母菌气味，产香酵母风味筛选结果见表3：不同产香酵母菌株的气味及强度有明显差异，R05、R07、R13无明显风味；R03、R04、R12、R14、R15风味强度较弱，表现为淡淡的酯香和醇香；R01、R02、R06、R08、R09、R10、R11、R16具有较浓厚的酯香、醇香、果香和蜜香，香气宜人。综上，初筛出R01、R02、R06、R08、R09、R10、R11、R16产香酵母菌株进行下一步复筛。
2.3 产香酵母的复筛
酯类是产香酵母代谢产生的主要风味物质，测定不同产香酵母发酵液的总酯含量，结果如图1所示：8株产香酵母的产酯能力均有差异，其中R09和R10发酵液的总酯含量明显相对较低，说明这2株酵母的产香、产酯能力相对较差；其中R01、R02、R06、R08、R11、R16发酵液的总酯含量较高，分别达到14.13、18.78、18.21、15.13、15.92、20.88 mg/L，说明这6株酵母的产香、产酯能力相对更佳。综上，复筛出R01、R02、R06、R08、R11、R16产香酵母菌株进行下一步分子生物学鉴定。
表2 酵母菌形态学分析结果
2.4 产香酵母的分子生物学鉴定
不同产香酵母菌株PCR扩增电泳图如图2所示：条带亮度较高，无拖尾现象，完整性较好，表明PCR产物可用于菌株序列测定。扩增产物于生物公司测序后利用Neighbor-Joining法构建系统发育树，不同产香酵母菌株系统发育树如图3所示，结果表明：6株产香酵母中R01、R02、R11与Wickerhamomyces anomalus（NG062034.1）同源性最高，相似度分别达到98.96%、99.43%、99.81%，可推断R01、R02、R11为异常威克汉姆酵母；R06、R08与Hanseniaspora guilliermondii（NG063249.1）同源性最高，相似度分别达到99.24%、99.14%，可推断R06、R08为季也蒙有孢汉逊酵母；R16与Saccharomycopsis fibuligera（NG065156.1）同源性最高，相似度达到99.44%，可推断R16为扣囊复膜酵母。
2.5 产香酵母的生长曲线
不同产香酵母菌株的生长曲线如图4所示，结果表明：6株产香酵母的延滞期、对数期、稳定期存在较大差异，R02、R08和R11的延滞期最短，为6–10 h，在15 h左右进入稳定期；R06较其他菌株生长相对缓慢，延滞期为25 h，在极35 h左右进入稳定期。6株产香酵母的最大菌体浓度也具有差异，其中R08能达到的最大菌体浓度最低。
表3 产香酵风味筛选结果
图1 不同产香酵母发酵液中总酯。不同产香酵母发酵液中总酯含量的差异用字母表示，不具有相同字母表示差异显著（P < 0.05）。
图2 不同产香酵母菌株PCR扩增电泳图。
图3 不同产香酵母菌株系统发育树。
图4 不同产香酵母菌株的生长曲线。
2.6 产香酵母的耐受性
二氧化硫是极果酒发酵常用的抑菌剂和防腐剂，研究不同产香酵母菌株对二氧化硫的耐受性，结果如图5a所示：在100–300 mg/L的二氧化硫含量条件下，6株酵母的OD值相对平稳；超过300 mg/L时，OD值呈现微弱下降趋势；在500 mg/L的二氧化硫含量条件下，OD值均还高于5.481 5。
选择7% vol的酒精度为最低乙醇耐受度，研究不同产香极酵母菌株对酒精度的耐受性，结果如图5b所示：R06、R08在酒精度为7% vol时不能生长；R01、R11在酒精度为9% vol时均能正常生长，酒精度达到11% vol时不能生长；极R02、R16在酒精度为9% vol时能正常生长，酒精度达到11% vol时菌体浓度急剧下降，但能继续生长。
初始糖度会影响果酒发酵的酒精度，初始糖度越高，酒精度就相对越高，研究不同产香酵母菌株对糖度的耐受性，结果如图5c所示：6株产香酵母随着初始糖度的增大，其OD值均有不同程度的降低。随着初始糖度的提高，R01、R02、R11、R16的OD值维持在较高水平且趋于稳定；R06、R08的OD值下降较为明显，R06最为明显。
温度影响酵母菌生长，高温会导致细胞代谢活动能力下降，选择在20–36 ℃范围内培养产香酵母48 h，研究不同产香酵母菌株对温度的耐受性，结果如图5d所示：在20–28 ℃时，6株产香酵母的OD值呈上升趋势，到28 ℃达到最高，说明它们的最适生长温度是28 ℃；而在28–36 ℃时，6株产香酵母的OD值呈下降趋势；在36 ℃，除了R08，其他均还能保持较高的OD值（> 5.481 5），说明它们具有较高的温度耐受性。
结合产香酵母分子学生物鉴定、生长曲线以及耐受性分析结果，综合考虑选择R02、R16菌株分别与酿酒酵母进行混菌发酵果酒，探究产香酵母混菌发酵在果酒中的应用。
2.7 产香酵母与酿酒酵母混菌发酵果酒的感官
感官评价是评定果酒品质的重要极指标，选择R02、R16分别与酿酒酵母混菌发酵梨酒、猕猴桃酒、苹果酒，对果酒的澄清度、典型性、滋味、平衡性、浓郁度和色泽6个方面进行感官分析以及与酿酒酵母单菌发酵果酒进行综合对比，结果如图6所示：在3种果酒中，R02、R16混菌发酵果酒均相对于酿酒酵母单菌发酵果酒在典型性、滋味、平衡性、浓郁度4个方面有显著提升，其中在典型性、滋味方面提升最为显著。综上所述，R02与酿酒酵母混菌发酵和R极16与酿酒酵母混菌发酵果酒均能有效提升果酒的感官品质，但在不同原料的极果酒各有侧重，主要从果酒的典型性和滋味来看，R16与酿酒酵母混菌发酵梨酒、苹果酒较R02表现更突出，R02与酿酒酵母混菌发酵猕猴桃酒较R16表现更突出。
2.8 产香酵母混菌发酵果酒的理化指标
根据GB/T 15038-2006和《葡萄酒、果酒通用分析方法》，测定酿酒酵母单菌发酵、R02与酿酒酵母发酵、R16与酿酒酵母混菌发酵酿造的猕猴桃酒、梨酒、苹果酒的理化指标，结果见表4。R02、R16混菌发酵的果酒，其酒精度、还原糖含量、总酸含量均能符合果酒酿造的生产需要。相对酵母单菌发酵，混菌发酵的猕猴桃酒的还原糖残糖显著提高，其他变化不明显；混菌发酵的梨酒的总酸含量均显著上升，还原糖残糖含量稍显降低，酒精度变化不明显；R02混菌发酵的苹果酒的酒精度稍显提高，其他变化不显著。综上，菌株R02和R16可作为果酒酿造的优质产香酵母，在果酒酿造的生产中具有较好的应用前景。
3 讨论与结论
本研究从新鲜的果皮、枝梗和大曲中共分离出16株具有典型酵母特征的菌株。经嗅闻法初筛、总酯测定复筛和分子生物学鉴定为6株产香酵母，经鉴定发现R01、R02、R11为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）；R06、R08为季也蒙有孢汉逊酵母（Hanseniaspora guilliermondii）；R16为扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）。
图5 不同产香酵母菌株耐受性分析。a：二氧化硫；b：酒精度；c：初始糖度；d：温度。同一菌株在单因素变量下OD值的差异用符号表示，其中R16菌株用小写英文字母表示，R08用数字表示，R06用大写英文字母表示，R01用希腊字母表示，R02用罗马数字表示，R11用汉字表示，不具有相同符号表示差异显著（P < 0.05）。
图6 产香酵母混菌发酵不同果酒感官分析雷达图。a：梨酒；b：猕猴桃酒；c：苹果酒。
蒙有孢汉逊酵母（Hanseniaspora guilliermondii）；R16为扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）。在产香酵母的生长特性研究中，延滞期短，说明酵母菌代谢速率加大，增殖速率加快。研究表明，5株产香酵母（R01、R02、R11、R08、R16）均具有较短的延滞期（6–15 h），适合果酒发酵，这与报道果酒发酵的产香酵母的延滞期相似。而果酒生产中，使用一定量的二氧化硫能够产生杀菌、抗氧化以及增加酸度等作用，本研究筛选的6株产香酵母菌均具有较高的二氧化硫耐受性，能在二氧化硫（<250 mmol/L）产生杀菌效果的环境中生长。糖在果酒中是发酵生产乙醇的主要来源和酵母生长的能源物质，但是高浓糖环境对酵母生长繁殖有抑制作用，高渗透压会导致酵母细胞水分流失，4株酵母菌（R01、R02、R11、R16）均具有较高的糖耐受性，适合果酒发酵环境。最关键的是，在果酒发酵过程中，产香酵母的生长繁殖会随着酒精度的升高而受到抑制，而本研究中的2株酵母（R02和R16）表现出很好的耐受性，在高达11%vol的酒精度下还能生长，比较适合果酒（10%vol–15%vol）的发酵环境。综合考虑，本研究选择R02和R16进行了后续与酿酒酵母的混菌发酵。从感官评价看，R16能显著提升果酒的平衡性和浓郁度，R02能显著提升果酒的典型性和滋味。而从理化评价可知，梨酒总酸升高（约44%），这可能与报道的异常威克汉姆酵母（R02）和扣囊复膜酵母（R16）具有较高的产酸能力相关；苹果酒无明显提升；猕猴桃还原糖残糖含量增加（约213%），这可能与异常威克汉姆酵母（R02）能够分泌β-D-葡萄糖苷酶、β-D-木糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶等多种糖苷酶，促进非发酵单糖（木糖、鼠李糖）的产生，从而导致果酒还原糖残糖含量的升高。
本研究通过形态学和嗅闻法初筛、发酵液总酯测定复筛、分子生物学鉴定，从新鲜果皮、枝梗和大曲样品中，筛选到两株优异的产香酵母，分别为异常威克汉姆酵母（R02）和扣囊复膜酵母（R16），它们具有较短的延滞期和较高的二氧化硫、酒精度、糖度以及温度耐受性。通过进一步与酿酒酵母混菌发酵，发现R02、R16与酿酒酵母混菌发酵极果酒均能有效提升果酒的感官品质，其中R16混菌发酵能显著提高梨酒中总酸含量，提升梨酒的平衡性和浓郁度；而R02混菌发酵能显著提高猕猴桃酒中还原糖残糖含量，提升果酒的典型性和滋味。因此，本研究筛选得到的异常威克汉姆酵母（R02）和扣囊复膜酵母（R16）均是果酒酿造的优质产香酵母，在果酒的生产酿造中具有较好的应用前景。在后续研究中，将深入探究产香酵母与酿酒酵母混合发酵的添加比例、接种方式及作用机制等，并通过长期跟踪和多角度分析来确认和优化混菌发酵对果酒质量的影响，以期更好地提升和改善果酒的风味品质，实现水果资源的利用更大化。