通过Box-Behnken优化培养基组成
根据上述结果，选择显著自变量[即蛋白胨（X1）、葡萄糖（X2）和MnSO4·H2O（X3）]用于Box-Behnken设计。相应的实验数据如表4所示。结果通过标准方差分析（ANOVA）进行分析，如表S1所示。模型的充分性通过确定系数评估。该模型呈现相对较高的F值（2522.51）、非常低的概率值（P>F=0.0001）和高系数（R2=0.9997），解释99.97%的响应变异性。X1、X2和X3的最佳浓度分别为25 g/L、24.86 g/L和0.2 g/L，导致最大理论OD600为1.78（表4）。为确认这些结果，在预测培养基条件下进行了额外的独立实验，重复三次，生物量平均值为1.772，与预测值一致。该优化策略使生物量从OD600 1.611提高至1.772。
MRS中微量元素对细胞生长的影响
根据表3中正交实验设计的ANOVA分析，MRS培养基中的许多微量元素，如K2HPO4、CH3COONa、MgSO4和柠檬酸铵，被认为对鼠李糖乳杆菌ZY的生物量没有显著影响。因此，进一步研究了从MRS培养基中简单去除这些微量元素的经济策略。实验设计如表5所示，针对以下培养基组成：原始MRS、OPT、无柠檬酸铵、或无K2HPO4、或无CH3COONa、或无MgSO4、以及无MRS中四种元素（mini-MRS）。微量元素对特定生长速率和最大生物量的影响如表5所示。显著影响特定生长速率的关键微量元素排序为：柠檬酸铵 > CH3COONa > MgSO4和K2HPO4。最后，在mini-MRS中发生最小OD600为1.339，其中去除了所有四种微量元素。如图2所示，鼠李糖乳杆菌ZY在6小时前的早期阶段在各种条件下生长相似。最后，在MRS、OPT和mini-MRS培养基中显示出生物量和特定生长速率的主要差异。这表明单个微量元素对细胞生长的影响略微显著，而总微量元素或含有补充来源也显著参与乳杆菌代谢。
细胞表面表征和蛋白质分析
代表在不同发酵条件下生长的细菌细胞的ATR-FTIR光谱。大分子功能群对应的吸收带分配总结在表S2中。在样本中，在光谱的碳水化合物区域（1200-950 cm-1）以及对应于磷酸盐（~1225 cm-1）拉伸、酰胺I和II带中C=O和C-N基团的区域观察到细微差异。这些结果表明细胞表面成分发生构象变化。然而，在不同培养条件下处理的样本中未观察到鼠李糖乳杆菌ZY表面特性的明显影响。据报道，发酵特性（包括生长培养基、发酵温度和pH）也影响细胞产量和细胞特性。因此，本研究采用FTIR光谱技术，该技术通过先进的化学计量学技术系统革新，从高光谱数据中提取（生物）化学信息，以研究培养基对鼠李糖乳杆菌ZY表面特性的影响。
此外，总细胞蛋白质的SDS-PAGE分析，随后进行聚类分析，如图4所示。这些结果表明，鼠李糖乳杆菌ZY在6小时具有相似的蛋白质模式，这与MRS、OPT和mini-MRS培养基在早期生长阶段的特定生长速率一致（图2），而三种条件下24小时的蛋白质谱不同。选择条带10作为Quantity One分析的内部标准，随后使用PermutMatrix软件进行双向层次聚类分析。如图4B所示，条带6、17和18对应于来自MRS培养的ZY菌株中的不同蛋白质（即黑色和红色条带）。条带6的蛋白质在MRS中明显显示比OPT和mini-MRS培养条件下浓度更高，而条带17和18的蛋白质浓度在OPT培养基中略高。因此，通过MALDI-TOF-TOF进一步分析四种选定蛋白质。详细的Mascot鉴定信息（表6）表明，通过质谱鉴定的蛋白质6是分子伴侣DnaK，蛋白质10是伴侣蛋白GroEL，蛋白质17是塔格糖-1,6-二磷酸醛缩酶，蛋白质18是30S核糖体蛋白S2。MRS培养基中的差异蛋白DnaK协助新生多肽链折叠和错误折叠蛋白质重折叠。关于塔格糖-1,6-二磷酸醛缩酶和核糖体蛋白，这些蛋白质受环境条件高度调控，以有效利用碳源，例如通过利用OPT培养基中更大量的葡萄糖。由于串联质谱技术可用于从复杂培养条件中发现差异蛋白质，并从新菌株中发现新酶，我们的结果通过这种替代蛋白质组学方法初步确定MRS培养基中对乳杆菌关键的成分是与碳源浓度相关的那些。通过转录水平检测关键因素浓度影响细胞生长的进一步研究是必要的。
结论
本研究通过正交实验设计成功解析了MRS培养基中各成分对鼠李糖乳杆菌ZY生长的影响，确定了葡萄糖、MnSO4·H2O和牛肉浸膏为最关键因素。通过Box-Behnken设计优化后，生物量从OD600 1.611显著提高至1.772。研究还发现，虽然单个微量元素对生长影响不显著，但完全去除微量元素会显著抑制生长。FTIR和蛋白质组学分析表明，不同培养基条件会影响细胞表面特性和蛋白质表达，特别是与碳源利用相关的蛋白质。这些发现为优化乳杆菌培养条件提供了重要理论基础和实践指导。
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