3.结果
3.1分子流行病学调查结果
499份腹泻样品中检出PEDV阳性162份，阳性率为35.2%。S基因测序分析显示，21株流行毒株间核苷酸同源性为96.9%～100%，氨基酸同源性为95.2%～100%；与2011–2019年国内流行毒株相比，核苷酸同源性为95.1%～99.5%，氨基酸同源性为91%～99.8%。系统发育分析表明，所有毒株均聚集于GIIb亚群，且S蛋白存在7个规律性氨基酸突变位点（如N347D、S553T等），提示病毒持续进化。
3.2病毒分离与鉴定结果
成功从阳性样品中分离获得两株PEDV：CHHNKF03（2020年）和CHHNPDS01（2021年）。RTPCR和IFA检测均为阳性，透射电镜下可见典型冠状病毒颗粒，直径约100–160 nm，表面有棒状突起。全基因组序列分析显示，两株病毒全长约28,033 bp，与GIIb群参考株核苷酸同源性为95.6%～98.7%，确认为当前主流变异株。
3.3病毒滴度与生长曲线测定（核心结果）
（1）基础病毒滴度
CHHNKF03株：TCID₅₀=10⁵.⁵/0.1 mL
CHHNPDS01株：TCID₅₀=10⁵.⁰/0.1 mL
（2）体外复制动态（生长曲线）
图1.PEDV CHHNKF03与CHHNPDS01株体外复制动态（生长曲线）
（注：横轴为感染后时间/h，纵轴为病毒滴度log₁₀TCID₅₀/0.1 mL，两条曲线分别代表两株病毒的滴度变化趋势，峰值点清晰标注）
如图1所示，两株病毒在Vero细胞中的复制曲线呈现典型S型增长：
CHHNKF03株：感染后6 h病毒滴度为10².⁵TCID₅₀/0.1 mL，12 h升至10³.⁸，18 h达10⁵.⁰，24 h达到峰值10⁶.⁰TCID₅₀/0.1 mL，30 h略有下降至10⁵.⁷，36 h为10⁵.⁵。
CHHNPDS01株：6 h为10².³，12 h为10³.⁶，18 h为10⁴.⁸，24 h为10⁵.⁴，30 h达峰值10⁵.⁸TCID₅₀/0.1 mL，36 h降至10⁵.⁶。
>结论：CHHNKF03株复制速度更快，潜伏期短，在24 h即达最大滴度；而CHHNPDS01株复制略慢，但峰值维持时间较长。该差异可能与其基因组非结构蛋白或S蛋白变异有关，提示在疫苗生产中需根据毒株特性设定最佳收毒时间。
（3）不同MOI对CHHNKF03株复制的影响
MOI=0.1、0.03、0.01：病毒滴度在24 h达到峰值（约10⁶.⁰TCID₅₀/0.1 mL）
MOI=0.006、0.002：滴度在30 h达峰（约10⁵.⁸TCID₅₀/0.1 mL）
综合病毒产量与接种成本，确定最佳感染复数为MOI=0.01，最佳收毒时间为感染后24 h。
（4）收毒方式比较
比较“仅上清液”与“上清+细胞冻融”两种方式，后者病毒滴度高出约0.5–1.0 log，表明细胞内存在大量未释放病毒粒子，推荐采用“上清与细胞混合液反复冻融”方式收毒。
3.4致病性验证（仔猪回归试验）
人工感染1日龄无母源抗体仔猪，两株病毒均引起100%发病率和100%死亡率，临床表现为严重水样腹泻、脱水、衰竭，病理剖检见小肠扩张、肠壁变薄，符合PED典型症状，证实为强毒株。
3.5灭活疫苗研制与免疫效果
（1）佐剂筛选
Freemix水性佐剂配苗后，免疫猪群抗体水平（ELISA）和中和抗体滴度均显著高于油佐剂和铝胶组，且局部反应小，确定为首选佐剂。
（2）攻毒保护试验
CHHNKF03灭活疫苗组：保护率80%（4/5存活）
商品化灭活疫苗组：保护率60%（3/5存活）
DMEM对照组：保护率20%（1/5存活）
免疫组仔猪腹泻症状明显减轻，死亡时间延迟，表明自研疫苗具有更优的交叉保护效果。
4.讨论
本研究系统揭示了河南省PEDV流行毒株的分子流行病学特征与生物学行为。35.2%的高阳性率提示PEDV在本地仍广泛传播。所有毒株均属GIIb群，且S蛋白出现新突变，可能影响抗原性与宿主适应性，解释了现有疫苗保护力下降的原因。
生长曲线测定是本研究的核心环节之一。结果显示，CHHNKF03株具有更快的复制速度和更高的峰值滴度，适合用于疫苗生产。其在MOI=0.01、24 h收毒时产量最高，为规模化培养提供了关键参数。相比之下，CHHNPDS01株虽滴度略低，但其持续复制能力可能反映更强的适应性，值得进一步研究。
基于CHHNKF03株研制的灭活疫苗在动物试验中表现出优于商品化疫苗的保护效果，可能得益于其抗原与当前流行株高度匹配。Freemix佐剂的应用也提升了免疫应答水平。
5.结论
1.河南省PEDV流行率较高（35.2%），当前流行毒株主要为GIIb亚群，S基因持续发生变异；
2.成功分离CHHNKF03和CHHNPDS01两株强毒，其体外复制动力学存在差异，CHHNKF03株在24 h达滴度峰值（10⁶.⁰TCID₅₀/0.1 mL），为疫苗生产最佳收毒时间点；
3.基于CHHNKF03株研制的灭活疫苗免疫效果良好，仔猪攻毒保护率达80%，具备推广应用潜力；
4.本研究为PEDV的精准防控、疫苗更新及病毒复制机制研究提供了重要数据支持。
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