摘要：益生元人乳寡糖存在于人乳中，婴儿不能消化，但能被有益的肠道细菌代谢。我们评估了乳杆菌科、双歧杆菌属和拟杆菌属内的57种细菌菌株以及潜在致病菌发酵HMOs 2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖和二岩藻糖基乳糖的能力。此外，还评估了益生元低聚半乳糖、乳糖、岩藻糖和葡萄糖作为这些细菌菌株碳源的情况。使用自动Bioscreen C系统监测细菌生长。只有某些双歧杆菌，如婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌，以及脆弱拟杆菌、普通拟杆菌和多形拟杆菌能够利用所研究的HMOs作为唯一碳源，而几乎所有研究的细菌菌株都能够利用GOS、乳糖和葡萄糖。HMOs仅被特定细菌选择性利用，这有利于促进有益微生物，而不支持有害病原体，这与其他选择性较差的益生元相比具有优势。
引言
人乳由婴儿生长、发育和抵御疾病所必需的营养物质和生物活性分子组成。人乳寡糖是人乳中第三大固体成分，估计由约200种不同结构组成。HMOs由葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖、岩藻糖和N-乙酰神经氨酸的组合构成，还原端有一个乳糖单元。不同HMOs的组成和浓度在哺乳期间随时间和个体之间存在差异。此外，分泌型和Lewis血型基因的遗传变异，分别编码a1-2岩藻糖基转移酶和a1-4岩藻糖基转移酶，是影响岩藻糖基化水平和岩藻糖基化HMOs水平的主要因素。在本研究中，我们重点关注岩藻糖基化的HMOs。
HMOs不被婴儿消化，但被某些有益的肠道细菌选择性利用，如婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌。除了这种益生元功能外，HMOs还可以阻碍病原体在肠道上皮细胞的粘附，直接影响肠道上皮细胞的成熟和发育，并支持免疫功能。
益生元是能被宿主微生物选择性利用并赋予宿主健康益处的化合物。最初，乳杆菌和双歧杆菌被认为是益生元效应的主要目标。随着我们对肠道微生物群认识的深入，益生元的定义已更新为包括能够赋予宿主健康益处的任何物种/属的增强。或者，病原菌数量的减少也可被视为间接的益生元效应。
低聚半乳糖是半乳糖的低聚糖混合物，还原端为葡萄糖。它们是通过β-半乳糖苷酶的转糖基活性从乳糖产生的，最终产物组成取决于各种糖苷键的存在而有所不同。GOS包含不同长度和键合的聚合物，聚合度范围为2至6。GOS在结构上不同于更复杂的HMOs，最显著的是缺乏唾液酸和岩藻糖残基。然而，由于报道的健康益处以及直到最近在商业上比HMOs更容易获得，GOS通常被添加到婴儿配方奶粉中。GOS作为益生元，可增加双歧杆菌和乳杆菌的数量，干扰某些病原菌的粘附，调节肠道屏障功能，并支持免疫力。
已证明婴儿双歧杆菌、脆弱拟杆菌和普通拟杆菌可以在从供体人乳中分离的HMOs混合物上生长，而青春双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种和加氏乳杆菌完全不能生长或利用HMOs的能力有限。此外，梭菌、真杆菌、肠球菌和大肠杆菌不能在HMOs混合物上生长，尽管在嗜酸乳杆菌NCFM中检测到轻微生长。Hoeffinger等人评估了几种单一HMO和其他益生元对11种肠杆菌科菌株生长的影响。根据他们的结果，所研究的菌株均不能在2'-岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸乳糖或乳糖-N-新四糖上生长。几种益生菌和人体分离的双歧杆菌和乳杆菌对纯HMOs及其单体的利用先前已有研究。两歧双歧杆菌、一些长双歧杆菌菌株和拟杆菌属物种使用细胞外酶在细胞外部分降解HMOs，然后将单糖、二糖或寡糖导入细胞内进行进一步降解。相比之下，婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌可以有效地将HMOs转运到细胞内并在细胞内消化。
纯化低聚半乳糖的制备。
将市售的Bimuno GOS粉末进行纯化以获得富含寡糖的GOS组分。首先，用乳糖酶对Bimuno GOS粉末进行酶处理，将乳糖水解成单糖（酶剂量为4.3μL/g Bimuno GOS粉末，在+40°C处理3.7小时，并在+80°C灭酶0.7小时）。然后，通过色谱柱，使用去离子水，将乳糖酶处理后的溶液用强酸阳离子树脂（Na+形式）洗脱，以去除单糖（进料脉冲体积为0.065床体积，流速为0.28 BV/h，温度为+65°C，床层高度为1.6 m）。从柱出口收集在进料脉冲开始后0.028至0.220 BV之间富含寡糖的组分。使用配备折射率检测器的Agilent 1100系列HPLC，以Aminex HPX-87 N Na+形式柱和超纯水作为洗脱液（流速0.6 mL/min），分析纯化的富含寡糖产物的组成。纯化的GOS产品将称为GOS-p。
在本研究中，我们评估了三种HMOs——2'-FL、3-岩藻糖基乳糖和DFL（二岩藻糖基乳糖，乳糖二岩藻糖四糖）——对益生菌和病原菌生长的影响。评估了广泛的益生菌选择，包括双歧杆菌和乳杆菌，以及24种市售菌株，此外还包括常见的婴儿病原体，如艰难梭菌、产气荚膜梭菌、阪崎克罗诺杆菌、沙门氏菌属和大肠杆菌。由于一些体外研究显示HMOs的利用存在菌株依赖性差异，我们包括了模式菌株以及益生菌和潜在致病菌株的选择。此外，将HMOs的效果与商业GOS和纯化的、富含寡糖的GOS组分的效果进行了比较。还评估了葡萄糖（作为阳性对照）、乳糖和岩藻糖（作为所研究HMOs的组分）的效果。
细菌菌株和生长培养基。
在本研究中，我们评估了广泛的双歧杆菌、乳杆菌（根据Zheng等人的新命名法）和潜在致病菌利用HMOs 2'-FL、3-FL和DFL生长的能力。总共评估了来自四个门的57种细菌菌株：放线菌门（16株）、厚壁菌门（26株）、拟杆菌门（3株）和变形菌门（12株）。从各种培养物保藏中心获得微生物菌株，并在适当的生长培养基[蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖肉汤（PYG）、改良的德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ）双歧杆菌培养基58、de Man,Rogosa,and Sharpe培养基（MRS）、改良强化梭菌培养基（RCM）或胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）]中，在厌氧或好氧条件下培养（表2）。如果需要厌氧培养基，则使用Hungate煮沸系统制备培养基和试管。通过将储存在-70°C的储备菌种或储存在4°C的安瓿瓶进行预培养过夜来制备微生物菌株。预培养后，将微生物接种到含有葡萄糖的新鲜生长培养基中，并在37°C或30°C下培养过夜（表2）。在未添加碳水化合物的培养基[PYG-、改良双歧杆菌培养基58-、MRS-、改良RCM-或TSB-]中制备细胞悬浮液（1%v/v），并立即用于进行生长测定。
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