摘要 由于益生菌对消化系统的强酸和高浓度胆汁盐环境较为敏感，并且在肠道中定殖能力较低，因此开发新颖有效的益生菌包埋体系用于解决上述问题很有必要。本研究使用羧甲基化β-葡聚糖（mGN），通过金属-酚醛网络结构（Fe-TA）的桥联作用，将其黏附在乳酸乳球菌（LL）表面，构建乳酸乳球菌的包埋体系LL@Fe-TA@mGN，并评价LL@Fe-TA@mGN 对胃液与胆盐的抗性及其在体内的滞留能力。结果表明：当mGN 的质量浓度为0.12 mg/mL 时，LL@Fe-TA@mGN 体系的粒径和zeta-电位都达到峰值，表明该质量浓度为mGN 包埋单个乳酸乳球菌的最佳质量浓度。在MRS 液体培养基中，LL@Fe-TA@mGN 的生长曲线与LL 的生长曲线没有显著性差异，说明mGN 的毒性可以忽略不计。在扫描电镜与透射电镜分析中均可清晰地看到一层“膜”完整地包覆在乳酸乳球菌表面。经2 h 模拟胃液与胆盐的孵育，mGN 包埋后的LL 抗胃液能力与抗胆盐能力相比于未包埋的LL 分别提升14.63 倍与1.94 倍。体内荧光成像实验证实LL@Fe-TA@mGN 具有更强的肠道滞留能力。综上，本研究开发的乳酸乳球菌单菌包埋技术能够显著提升乳酸乳球菌的胃肠道抗性与体内滞留能力。研究结果可为益生菌包埋系统的开发与利用提供新的思路和策略。
1980 年，俄罗斯诺贝尔奖获得者 Elie Metchnikoff 首次提出益生菌的概念，阐述了乳酸菌对人体的潜在益处，并提出乳酸菌长寿论。在随后的几十年时间里，人们对益生菌的研究越来越深入。研究表明，益生菌对宿主健康状况存在积极的影响。保持益生菌在胃肠道的高存活率，是益生菌在宿主体内发挥有效功能的必要条件。然而，在口服过程中，由于益生菌对胃肠道强酸和高浓度胆汁盐的环境较为敏感，经胃肠道消化后很难存活与定殖，使最终定殖在肠道中的益生菌的数量低于世界粮农组织（FAO）所建议的最低理论值。此外，由于益生菌对肠壁的附着力差，定殖效率低，进一步影响了益生菌的功效。鉴于此，研究开发保护益生菌的方法，对于提高益生菌在胃肠道的存活率及在肠道的定殖率具有重大的现实意义。
目前，有多种方法可以帮助益生菌在口服过程中存活和繁衍，并提高益生菌的肠道定殖效率，如挤出、冷冻干燥、喷雾干燥和微胶囊化等。这些方法虽然在一定程度上提升了益生菌在肠道中的活性，但是存在操作复杂、产率低等问题，同时可能对益生菌造成机械损伤。因此，迫切需要找到一种简单有效的方法来包埋益生菌，以增强益生菌对胃肠道环境应激的抵抗能力，延长益生菌在肠道的滞留时间，提高益生菌定殖率，达到更好地发挥益生菌在体内效能的目的。
选择合适的壁材与包埋方法对益生菌的有效包埋至关重要。β-葡聚糖（GN）是一种常见的益生元，广泛存在于大麦、小麦和燕麦等天然植物中，可被肠道菌群代谢为短链脂肪酸，表现出丰富的生理活性，如改善肠道环境，增加肠道菌群丰度和修复肠道屏障等。除了优越的生物活性，GN的大孔蜂窝状结构，可以比任何其它壁材更有效地捕获微生物。由于GN 在上消化道稳定，可以减轻益生菌在进入肠道过程中失活的风险，提高益生菌的存活率，并将益生菌高浓度地输送到指定部位，因此现已作为益生菌包埋壁材使用。朱莹莹等利用青稞β-葡聚糖对植物乳杆菌进行包埋，显著地提升了植物乳杆菌的胃肠道耐受性。然而，GN 存在黏度大、溶解性差等问题。羧甲基化β-葡聚糖（mGN）在不改变GN 空间结构的同时，在很大程度上解决了其难溶于水的问题，并提升了GN 的生物活性。然而，mGN 无法直接黏附在单个益生菌的表面对其进行保护。寻找到能够连接内层益生菌与壁材mGN 的 “桥梁”，是实现mGN 对单个益生菌包埋的关键。金属-酚醛网络是由酚类配体（如单宁酸）和金属离子（如Fe3+）组成的超分子复合物，可通过一步法简便地组装成配位络合物，并黏附在多种材料表面。酚类物质具有较多羟基和较高的黏附能力，可通过氢键作用将mGN 吸附到金属-酚醛网络结构的表面，达到mGN 对益生菌包埋的目的。
乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，LL）是乳酸菌属中的一种重要模式菌，同样也是食品级微生物（Generally regards as safe，GRAS），被广泛应用于食品工业。LL 具有促进消化，维持肠胃菌群平衡，提高宿主免疫力和加固肠道黏膜等作用。然而，关于乳酸乳球菌包埋的研究较少，而包埋单个乳酸乳球菌的研究更鲜见报道。基于此，本研究以mGN 作为壁材，通过金属-酚醛网络的桥联作用，将mGN 黏附在LL 表面，旨在探究其对所包埋的LL 胃肠道耐受性及肠道滞留能力的影响。
1 材料与方法
1.1 原料、菌种、试剂与实验动物
乳酸乳球菌由南昌大学陈廷涛教授团队提供。MRS 液体培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；单宁酸（Tannic acid，TA），美国Sigma-Aldrich；六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O），西陇科学股份有限公司；Sulfo-Cyanine5-DBCO（Cy5），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Phosphate buffer saline（PBS）缓冲片，武汉赛维尔生物科技有限公司；β-葡聚糖，爱尔兰Megazyme 有限公司。本研究中使用的所有其它试剂均为分析纯级。
10 只SPF 级C56BL/6J 雄鼠，体质量（20±2）g，周龄6～8 周，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2019-0010）。饲养条件：房间温度为（22±1）℃，12 h/12 h 的灯光/黑夜循环。小鼠在自由饮食、饮水饲养适应环境1 周后，将小鼠随机分为2 组，每组5 只，分别为LL 灌胃组与LL@Fe-TA@mGN 灌胃组。
1.2 设备与仪器
BSC-1304ⅡA2 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HPX-11-80 生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；TD5A-WS 台式低速离心机，湖南湘怡实验室仪器开发有限公司；ZWYR-200D恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；马尔文3000 激光粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；JSM-6701F 冷场发射扫描电子显微镜（Cold field emission scanning electron microscope，SEM），日本电子株式会社；透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM），日本日立公司；活体成像系统，深圳凯佳光学科技有限公司。
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