嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila隶属弧菌科、气单胞菌属，是一种革兰氏阴性条件致病菌，广泛存在于淡水、污水、土壤及人体粪便中。鱼感染该菌后鳃部、体表出血溃烂，内脏发白，可引起急性胃炎、肠炎等病症，是一种典型“人-兽-鱼”共患病原菌。近年来由嗜水气单胞菌引发水生动物的病例不断增多，是水生动物尤其是鱼类最常见的致病菌。该菌严重威胁水产养殖业的发展和人类健康。研究表明，选择具有代表性的免疫原性好的嗜水气单胞菌菌株，制备灭活疫苗，用于鱼类浸泡或注射免疫，在鱼类嗜水气单胞菌病防控上取得了良好效果。在规模化生产菌体过程中，细菌的数量和致病力受温度、盐度、pH、碳源、氮源等培养条件的影响。本试验通过研究不同培养条件下嗜水气单胞菌的生长，优化工业化生产嗜水气单胞菌的培养条件，以期为嗜水气单胞菌工业化生产该菌灭活疫苗及防控鱼类嗜水气单胞菌病提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
嗜水气单胞菌GZ1株由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室保存。
胰蛋白胨、酵母粉与琼脂糖均购自上海博微生物科技有限公司；NaCl购自重庆川江化学试剂公司；HCl（分析纯度38%）和NaOH（分析纯度32%），均购自杭州联科生物有限公司；可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、硫酸镁等均购自上成都市科龙化工试剂厂。
1.2方法
1.2.1菌种培养方法
将菌株划线接种在以胰蛋白胨为氮源、酵母粉为碳源的LB固体培养基上，37℃恒温培养24h，挑取单个菌落，接种LB液体培养基，30℃摇床振荡培养24h，8000r/min，离心5min，取菌体，用无菌PBS洗涤3次，取沉淀，配制成浓度为1×108cfu/mL菌悬液，4℃保藏备用。
1.2.2不同培养条件对嗜水气单胞菌GZ1株生长状况的影响
取培养24h菌液，8000r/min离心5min，取菌体，无菌PBS洗涤3次，取菌悬液0.5mL，加PBS至5mL，倍比稀释，用平板计数法测定菌液细菌含量，以无菌PBS为对照，以菌液细菌含量为Y轴，菌液OD600为X轴，构建回归方程。
生长曲线的测定：将上述菌液接种于LB液体培养基，30℃摇床振荡（180r/min）培养，用分光光度计测定培养第2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、18℃、24℃、36℃、48h菌液OD600，用回归方程公式计算细菌浓度，以培养时间为横坐标，细菌浓度为纵坐标，绘制嗜水气单胞菌生长曲线。
温度：培养温度分别设为4℃、25℃、28℃、30℃和37℃，方法同1.2.2，24h时以无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较温度对GZ1株生长的影响。
pH：用NaOH和HCl调节培养基pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，每个处理设3个重复，24h时以无菌LB液体培养基为对照，比较pH对GZ1株的影响。
NaCl浓度：分别调制0%、1%、2%、3%、4%和5%NaCl的LB液体培养基，加入1%对数期GZ1株菌液，30℃、180 r/min振荡培养24h，以无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较NaCl浓度对GZ1株生长的影响。
Mg2+浓度：添加硫酸镁，调制Mg2+浓度分别为1mg/L、2.5mg/L、5mg/L和10 mg/L的LB培养基，培养24h时以无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较Mg2+浓度对GZ1株生长的影响。
碳源：用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸、碳酸钠配制成碳浓度为0.42 g/L的不同碳源培养基，培养24h时以无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较碳源对GZ1株生长的影响。
氮源：用氯化铵、硫酸铵、尿素、蛋白胨、酵母粉配制成氮浓度为0.71g/L的不同氮源培养基，加入1%对数期GZ1株菌液30℃、180 r/min振荡培养24h，无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较氮源对GZ1株生长的影响。
1.2.3正交试验设计
在单因素对嗜水气单胞菌GZ1株生长影响的基础上，取温度、pH、NaCl浓度、Mg2+浓度4个因素作为考察因素，每个因素设3个水平，以细菌浓度为指标，设计正交试验表1。
表1正交试验设计表
1.2.4数据处理
结果以平均数和标准偏差表示（x±s），用excel、SPSS19.0软件进行分析。
2结果与分析
2.1嗜水气单胞菌GZ1株的浓度与OD600的线性方程与生长曲线
细菌含量与OD600成线性关系（图1），其回归方程为：Y=17.65X+0.43，Y为细菌含量（×108cfu·mL-1），X为OD600。
图1嗜水气单胞菌GZ1株的浓度与OD600的线性方程
由图2可知，在30℃时，前12h为该菌生长延迟期，12～24h为生长对数期，24～36h为生长稳定期，36 h后进入衰亡期。
图2嗜水气单胞菌GZ1株生长曲线
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