1.3.3 PMEC生长曲线的绘制
采用CCK-8法进行PMEC生长曲线的绘制。将生长状态良好的第9代PMEC常规消化后进行细胞计数，以1×104个/mL的浓度接种到96孔板中，共分为6个组，每组5个重复，每孔中加入100μL完全培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养，分别于接种后1、3、5、7、8 d加入10μL CCK-8试剂，同时设阴性对照，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)值，以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制PMEC的生长曲线。
1.3.4 IFA检测ZO-1蛋白分布
免疫荧光检测PMEC之间ZO-1蛋白的分布，具体步骤:将生长状态良好的第9代PMEC常规消化后进行细胞计数，以3×105个/mL的浓度接种到Transwell小室的上室中，并加入200μL完全培养基，下室中加入800μL完全培养基，培养6~8 d后，使用手术刀片和眼科镊将小室中的聚碳酸酯膜撕下并贴于载玻片上，随后将载玻片上的聚碳酸酯膜用免疫组化笔圈出并滴加无水甲醇于-20℃固定10 min，200μL PBS洗涤3次后，滴加200μL 2%牛血清白蛋白(BSA)-PBS溶液于37℃恒温培养箱封闭1 h，进一步滴加200μL(用1%的BSA-PBS溶液稀释)ZO-1抗体(1∶100)，4℃孵育过夜;洗去一抗并在圈内的膜中滴加200μL(用1%的BSA-PBS溶液稀释)AF594山羊抗兔IgG(1∶200)，室温孵育45 min后，200μL PBS洗涤3次;加入100μL(用1%的BSA-PBS溶液稀释)核染液Bisbenzimde(1∶2 000)，室温避光显色10 min，200μL PBS洗涤3次后拍照。
1.3.5催乳素刺激PMEC
将消化下来的PMEC进行细胞计数，分为对照组及0.2 mg/L和2 mg/L催乳素刺激组，将细胞接种在12孔板上，每组3个重复孔，每孔加1 mL含10%FBS、2%抗生素溶液、50 mg/L庆大霉素、5 mg/L牛胰岛素、5 mg/L氢化可的松的DMEM营养液(不含EGF)，观察细胞生长状况，当每孔细胞达到70%聚集时，对各孔细胞进行换液，对照组的营养液与原营养液相同，催乳素刺激组的营养液为1 mL含10%FBS、2%抗生素溶液、50 mg/L庆大霉素、5 mg/L牛胰岛素、5 mg/L氢化可的松、0.2 mg/L或2 mg/L催乳素的DMEM溶液(不含EGF)。最后培养3 d，每天换一次营养液。72 h后收样，加入TRIzol或细胞裂解液提取核酸或蛋白。
1.3.6 IFA鉴定CK-18表达
将PMEC均匀铺在96孔板上，分为阴性对照组和试验组，每组8个重复，验证PMEC中CK-18的表达，待孔中细胞长到90%聚集时，弃去孔内培养液，常温PBS洗涤细胞2次并弃去。每孔加入预冷的无水甲醇，-20℃固定10 min，200μL PBS洗涤3次，弃去后每孔加入100μL的2%BSA-PBS封闭液于37℃，封闭1 h。弃去每孔液体，试验组每孔加入100μL(用1%的BSA-PBS溶液稀释)CK-18抗体(1∶200);对照组每孔加入100μL 1%BSA-PBS稀释液，37℃孵育1 h。200μL PBS洗涤3次后，每孔加入100μL(用1%的BSA-PBS溶液稀释)由YF488标记的山羊抗兔IgG(1∶200)，于37℃孵育45 min。200μL PBS洗涤3次后，每孔加入50μL(用1%的BSA-PBS溶液稀释)核染液Bisbenzimde(1∶2 000)，室温避光显色10 min，200μL PBS洗涤3次后，置于荧光显微镜下观察并拍照。
1.3.7 RT-PCR检测CNS2基因的转录
使用TRIzol总RNA提取试剂从猪乳汁和PMEC中提取总RNA，并将其反转录为cDNA。采用PCR检测CNS2基因(GenBank登录号:GU827390.1)的表达。引物序列:F:5′-ATTGTTCCCAAGCGTAA-3′，R:5′-GAGACTGGAGCAGAGGC-3′。PCR体系(20μL):10μL 2×Es Taq MasterMix(Dye)，7μL ddH2 O，25μmol/L上下游引物各0.5μL，2μL cDNA(100 ng/μL)。反应程序:94℃3 min预变性;94℃30 s变性，46℃30 s，72℃30 s，35个循环;72℃10 min。
1.3.8 Western blot鉴定CNS2蛋白的表达
将PMEC均匀铺在12孔板，分别用0.2μg/mL和2μg/mL催乳素处理3 d后，收取样品，在细胞中加入细胞裂解液，4℃离心1 500 r/min，10 min，取上清液。加入5×SDS上样缓冲液混匀后，105℃变性10 min，蛋白样品即制备完毕。同时提取猪乳汁蛋白作为阳性对照。
配制12%SDS-PAGE，电泳完毕后，将滤纸、分离胶浸泡于转膜液中20 min。将PVDF膜放于100%甲醇中浸泡5 min，20%甲醇中浸泡2 min。处理完毕后，将三明治结构放于半干转膜装置上，从负极开始依次是:滤纸、分离胶、PVDF膜、滤纸，盖上电极，接通电源，23 V电压30 min。
转膜完毕后，将PVDF膜置于平皿中，用10 mL TBST稀释的5%脱脂奶封闭PVDF膜，室温2 h。封闭完毕后，将PVDF膜置于平皿中，加入1∶500稀释的抗CNS2抗体4℃孵育过夜。孵育完成后，使用TSBT洗膜3次，每次10 min。最后加入1∶5 000稀释的山羊抗兔酶标二抗，室温孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。用ECL化学发光超敏显色A液和B液等比例混合，均匀滴加到目的条带处，曝光30 s，观察结果。
1.3.9统计分析
所有数据使用GraphPad Prism 8.0软件对试验数据进行作图。使用SPSS 26.0软件的单因素方差分析(ANOVA)检查组间显著性。结果以“平均值±标准误”表示。以P<0.05表示差异显著。
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