3讨论
当前，应用于水稻白叶枯病防治的化学药剂存在种类少、对环境影响大且因长期使用而导致功效不足等问题，因此寻找安全高效的新型抗菌剂以防治水稻细菌病害是当前的迫切需求。噬菌体是一种能够特异性裂解细菌的病毒，能够有效防治多种病原菌，且不会对其他有益微生物群落造成影响，被视为理想抗菌剂之一。如今随着研究的深入，噬菌体在医疗、农业、食品等领域的细菌防治中扮演了越来越重要的角色。
本文从稻虾田水中分离得到一株能够裂解水稻黄单胞菌的噬菌体vB_XaS_HDB2。用于生物防治的噬菌体必须遗传背景清晰，且不携带耐药和毒力基因，否则可能造成耐药和毒力基因在细菌间水平转移。裂解模块直接参与细菌裂解，HDB2裂解模块中具有3个ORF 21、22、23，分别被注释为穿孔素(holin)、裂解酶(lysin)和膜融合蛋白(spanin)。噬菌体介导的革兰氏阳性菌裂解通常由穿孔素—裂解酶系统参与;裂解酶是噬菌体在复制后期表达的一类水解酶，作用于细胞壁肽聚糖，导致细胞壁破裂从而释放子代噬菌体;穿孔素是一种跨膜蛋白，能够在细胞膜中形成非特异性的跨膜通道，以便释放细胞内的裂解酶。膜融合蛋白是裂解革兰氏阴性菌所需的第3种蛋白。革兰氏阴性菌因其外膜保护肽聚糖层，对噬菌体裂解酶具有天然的抗性，因此还需要膜融合蛋白介导产生横跨内、外膜的通道，帮助子代噬菌体释放。裂解酶因其能特异性消灭细菌且不易产生抗性、裂解谱较宽广等特点同样引起了研究人员的注意，成为了当前的研究热点。将来我们可以进一步尝试对噬菌体HDB2的裂解酶进行过表达，探究其杀菌能力。
HDB2不含毒力基因和抗生素耐药基因，表明该噬菌体在基因水平上具有较好的安全性，可以用于细菌的防治。同时，HDB2含有一个tRNA基因，对于噬菌体编码的tRNA的作用，暂时还未有明确的解释，目前最广泛接受的假设是密码子补偿，即宿主很少使用但噬菌体必需的密码子是由噬菌体编码的tRNA补充的。而近年来Yang等提出的“噬菌体tRNA代表了一种抵消宿主tRNA耗竭的手段”说法也获得了部分人支持，该观点认为通过下调噬菌体tRNA的表达，修改tRNA使其无法用于翻译等使噬菌体tRNA可以作为一种机制来抵消噬菌体感染期间反密码子核酸酶对tRNA的消耗，从而使噬菌体能够翻译其蛋白质并成功完成感染周期。有研究分析了烈性噬菌体与溶源噬菌体之间的差异，发现烈性噬菌体含有更多的tRNA，推测tRNA可能有助于噬菌体获取更高的裂解性。此外还有关于噬菌体tRNA有助于在感染期间维持生长或扩大噬菌体的宿主范围等假设。在本团队的烈性噬菌体资源库中，噬菌体vB_BceS_LY1、vB_VpaP_DE10、vB_VpP_DE17、vB_VpaP_FE11、vB_VpP_ AC2均未预测到tRNA基因，vB_VpP_BA6被预测含有3个tRNA基因、vB_VpS_CA8和vB_ VpS_BA3含有1个tRNA，关于噬菌体tRNA的功能作用，还有待进一步研究。
本试验将噬菌体与宿主菌共培养，初步探究了噬菌体HDB2在体外试验中对宿主菌的抑菌效果，为噬菌体应用提供了参考。结果显示，添加的噬菌体数量越多即MOI越高，抑菌效果越明显。值得注意的是将噬菌体与宿主菌共培养的48 h内，出现了细菌浓度先降低后升高的现象，推测这是因为刚开始噬菌体大量裂解细菌导致菌液浓度降低，但后续由于噬菌体抗性菌的出现，细菌再度增长。噬菌体和它们的宿主细菌会不断的共同进化，在此过程中，细菌主要以3种方式逃避噬菌体感染。第1种是受体适应，噬菌体感染成功的关键是噬菌体与细菌表面受体特异性结合，细菌通过随机突变或者水平基因转移，使得受体变异，噬菌体无法吸附，从而抵挡住噬菌体感染。第2种是宿主防御系统保护，细菌在被噬菌体侵染过程中进化出各种免疫系统来抵御噬菌体感染。目前已知最广泛的防御系统是细菌限制修饰(restriction modification，RM)系统，RM系统作为免疫系统攻击进入细胞的噬菌体DNA，从而使这些DNA被限制性内切酶水解，而细菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护起来，使得细菌不会受到伤害。此外还有CRISPR-Cas系统、流产感染(abortive infection，Abi)系统等。第3类是噬菌体衍生防御系统。如Sie系统，这是噬菌体进入宿主后为细菌提供的防御系统，目的在于防止细菌被相同或密切相关的噬菌体再次感染。噬菌体抗性菌的产生使其抑制细菌的效果大大被削弱，这是噬菌体防治细菌感染需要解决的主要问题之一。针对这一问题，研究学者们提出了噬菌体鸡尾酒疗法，噬菌体—抗生素联合应用，使用基因工程改造噬菌体以及利用噬菌体裂解酶疗法等新的策略来应对。使用不同组合的噬菌体鸡尾酒除能够扩大宿主谱、增强杀菌性能外，还可以有效抑制或延缓噬菌体耐药性的出现。Yoo等利用噬菌体抗性细菌分离得到的4株噬菌体构建了3种噬菌体鸡尾酒，它们对多重耐药肺炎克雷伯菌表现出较强的抑制能力。值得注意的是，有些已经对噬菌体产生抗性的细菌菌株，在加入噬菌体鸡尾酒后，对鸡尾酒中其他噬菌体产生抗性后，可以对原来的噬菌体重新敏感。此外，研究人员认为，噬菌体耐药性的出现可能会影响细菌对抗生素的敏感性，使得细菌对抗生素重新敏感。他们推测是因为噬菌体在侵染细菌过程中可能依赖于细胞膜蛋白或其他表面结构，而在某些情况下，这些结构也与细菌的抗生素耐药性密切相关。因此，先单独使用噬菌体进行治疗，在产生噬菌体抗性后再转向使用抗生素也是对抗噬菌体抗性的对策之一。
4结论
本文分离得到的黄单胞菌噬菌体vB_XaS_HDB2耐受性强，对紫外线较敏感，不含毒力基因和耐药基因，安全性较高。MOI大于0.1时，HDB2对黄单胞菌有较好的抑制效果，具有作为新型抗菌剂防治水稻白叶枯病的潜力，可为噬菌体进一步研究与应用提供理论依据。