【背景】玉米迪克氏菌(Dickeya zeae)可引起作物细菌性软腐病，严重威胁香蕉、水稻等重要作物的生产安全。本研究在香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS1的Tn5突变体库中筛选到4个毒力显著减弱的突变体。
【目的】进一步鉴定Tn5转座子插入突变体的具体基因位点，并明确该基因对细菌毒力的影响。
【方法】通过热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,TAIL-PCR)鉴定转座子插入位点；利用同源重组方法构建插入基因的敲除突变体及其互补菌株，并比较它们与野生型在细菌生长、相关代谢产物活性、植物细胞壁降解酶(plant cell wall-degrading enzymes,PCWDEs)分泌、运动性及毒力等方面的差异。
【结果】TAIL-PCR鉴定出4个突变体的转座子插入位点均是位于α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,α-KGDH)基因sucA内，该基因编码三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环过程的关键酶组分。基因敲除突变体ΔsucA在细菌生长曲线上受到一定程度的影响，但是其α-KGDH活性完全丧失。基因突变可显著减少PCWDEs的分泌并降低pelB和pelC等基因的转录表达，而不影响细菌的涌动、游动能力。对比野生型，ΔsucA在烟叶上产生的过敏性反应明显减弱，对香蕉幼苗的致病性也显著降低。回补菌株则可将上述细菌表型均恢复至与野生型接近的水平。【结论】本研究利用Tn5转座子插入突变鉴定到可影响细菌毒力的TCA关键酶基因sucA，该基因的突变可减弱重要毒力因子PCWDEs的分泌，但不影响细菌运动性。
玉米迪克氏菌(Dickeya zeae)，原名Erwinia chrysanthemi pv.zeae，可引起香蕉、水稻、马铃薯和玉米等重要作物的细菌性软腐病发生，并在全球范围内造成严重减产。在粮食作物上，由D.zeae引起的水稻基腐病和玉米细菌性茎腐病在易感品种或有利于病原菌生长的环境条件下发生较为普遍。在华南地区，由D.zeae引起的香蕉细菌性软腐病最初在广东省被发现，随后迅速传播至中国广西、云南、海南和福建等地；由于病害传播速度快、传播范围广和发病症状严重，该病害已成为香蕉生产过程中的重要威胁。
目前，已报道的与迪克氏菌属(Dickeya)侵染寄主植物相关的毒力因子主要包括：植物细胞壁降解酶(plant cell wall-degrading enzymes,PCWDEs)、细菌分泌系统、鞭毛运动性、群体感应信号和细菌生物被膜等。不同毒力因子间多表现密切的联系，果胶裂解酶(pectate lyase,Pel)和纤维素酶(cellulose,Cel)通过II型分泌系统(typeⅡsecretion system,T2SS)分泌至Dickeya胞外，蛋白酶(protease,Prt)则利用I型分泌系统(type I secretion system,T1SS)进行分泌。在很多情况下，同一基因的突变常可影响上述不同毒力因子的作用，并进一步减弱细菌毒力，如转录调控基因fis的敲除突变可减少PCWDEs的产生，降低细菌的游动性和群集运动性，减少生物被膜的形成和zeamine毒素的产生，从而影响其对水稻种子的致病性；编码MarR家族转录调节因子的slyA发生突变后，D.zeae生物被膜形成能力、细菌运动性和毒力均降低，并且其PCWDEs的产生也受到不同程度的影响；此外，研究发现有机过氧化物还原酶调节因子(organic hydroperoxide reductase regulator,OhrR)可调节Cel的产生，并影响细菌运动性、生物被膜形成及对于双子叶植物和单子叶植物的毒力。
细菌的毒力调控机制较为复杂，除上述常见的毒力因子外，仍然有较多的毒力调控机制有待进一步探讨。如，三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环作为细胞中产生能量的关键代谢途径，已有报道表明细菌可通过该途径来影响细胞行为和毒力因子。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica)中，多个TCA循环基因的突变导致其对于BALB/c小鼠上的毒力减弱；相较于鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)野生型，TCA循环基因突变体对鲶鱼的毒力显著减弱；在大肠杆菌(Escherichia coli)中，ymdB突变可介导sucA的下调表达，进一步导致生物被膜形成减少。在达旦提迪克氏菌(Dickeya dadantii)中，2个TCA循环基因fumA和sdhCDAB的突变则可导致细胞内环状二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c di-GMP)浓度降低，进而增加Pel的产生。因此，本研究构建香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS1的Tn5转座子插入突变体库并筛选毒力减弱的突变体，探索更多潜在的可影响D.zeae细菌毒力的调控机制；同时，通过鉴定Tn5转座子插入的基因位点、构建被插入基因的敲除突变体与回补菌株等方法，研究基因敲除突变后细菌生长代谢、PCWDEs分泌和相关基因表达及细菌运动性等方面产生的变化，明确该基因对于D.zeae细菌毒力的影响，以期为细菌性软腐病菌致病机制提供新的见解。
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